इन विट्रो में और Vivo में आंतों उपकला कोशिका पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए दृष्टिकोण
Summary
दो तरीके आंतों बाधा समारोह का निर्धारण करने के लिए यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. एक उपकला मीटर (वाल्ट/ओम) सीधे टिशू कल्चर कुओं में कल्चरल epithelia के transepithelial विद्युत प्रतिरोध की माप के लिए प्रयोग किया जाता है । चूहों में, FITC-dextran gavage विधि vivo मेंआंतों पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
आंतों बाधा रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विष के खिलाफ बचाव । अपने कार्य तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है, और आंत्र बाधा समारोह के विघटन जठरांत्र और प्रणालीगत रोग की प्रगति के लिए योगदान देता है. आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने के लिए दो सरल तरीके यहाँ वर्णित हैं. इन विट्रो में, कएको छैन-2BBe कोशिकाओं ऊतक संस्कृति कुओं में एक monolayer और transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तेर) के रूप में चढ़ाया जाता है एक उपकला (वाल्ट/ओम) मीटर से मापा जा सकता है । यह विधि अपने उपयोगकर्ता के अनुकूल संचालन और दोहराव की वजह से कायल है । vivo में, चूहों 4 केडीए fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran के साथ gavaged हैं, और FITC-dextran सांद्रता चूहों से एकत्र सीरम नमूनों में मापा जाता है उपकला पारगम्यता का निर्धारण करने के लिए. मौखिक gavage एक सटीक खुराक प्रदान करता है, और इसलिए vivo मेंआंतों पारगम्यता को मापने के लिए पसंदीदा तरीका है. एक साथ ले लिया, इन दो तरीकों इन विट्रो और vivoमें आंतों उपकला की पारगम्यता को मापने कर सकते हैं, और इसलिए रोगों और बाधा समारोह के बीच कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा.
Introduction
आंत्र उपकला कोशिकाओं केवल पोषक तत्वों के अवशोषण के लिए जिम्मेदार नहीं हैं, लेकिन यह भी रोगजनक सूक्ष्मजीवों और माइक्रोबियल विषाक्त पदार्थों के खिलाफ की रक्षा के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा फार्म । इस आंत्र बाधा समारोह तंग जंक्शन पारगम्यता और उपकला कोशिका अखंडता द्वारा विनियमित है1,2,3, और उपकला बाधा समारोह की शिथिलता भड़काऊ आंत्र के साथ जुड़ा हुआ है रोग (आईबीडी) । perijunctional actomyosin रिंग (PAMR) उस सेल के भीतर निहित है जो तंग जंक्शनों के निकट है । PAMR के संकुचन, जो मायोसिन प्रकाश श्रृंखला (विधान परिषद) द्वारा विनियमित है, तंग जंक्शन पारगम्यता के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है4,5,6,7,8, 9,10. ट्यूमर परिगलन कारक (TNF) आंत्र उपकला विधान परिषद कळेनासे (MLCK) अभिव्यक्ति और उत्प्रेरण occludin internalization11,12,13द्वारा आंत्र बाधा घटाने के लिए केंद्रीय है ।
ऐसे एनए+ और सीएल के रूप में आयनों या तो ताकना या रिसाव मार्ग14से paracellular अंतरिक्ष को पार कर सकते हैं । एक “टपका हुआ” उपकला में, तेर में परिवर्तन मुख्य रूप से बदल तंग जंक्शन पारगम्यता को प्रतिबिंबित. तेर माप एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया electrophysiological दृष्टिकोण है तंग जंक्शन पारगम्यता, मुख्य रूप से नाकरने के लिए+ और सीएल, सेल monolayers के प्रतिबाधा पर आधारित है । आंत्र उपकला कोशिकाओं, फेफड़े के उपकला कोशिकाओं, और संवहनी endothelial कोशिकाओं सहित विविध कोशिका प्रकार, तेर माप के लिए सूचित किया गया है. इस विधि के लाभ कर रहे है कि तेर माप गैर इनवेसिव रहे है और वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, तेर माप तकनीक दवा विषाक्तता अध्ययन के लिए उपयोगी है15.
कएको छैन-2BBe कोशिकाओं मानव उपकला कोलोरेक्टल ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं के साथ एक संरचना और समारोह विभेदित छोटे आंत्र उपकला कोशिकाओं के लिए समान हैं: उदाहरण के लिए, इन कोशिकाओं microvilli और छोटे आंत्र ब्रश के साथ जुड़े एंजाइमों है बॉर्डर. इसलिए, कल्चरल कएको छैन-2BBe monolayers में एक इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है बैरियर समारोह परीक्षण के लिए.
चूहों में, आंतों paracellular पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए एक तरीका रक्त में लुमेन से पार करने के लिए FITC-dextran की क्षमता को मापने के द्वारा है । इस प्रकार, आंतों पारगम्यता gavaging FITC द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता-dextran सीधे चूहों में और रक्त के भीतर प्रतिदीप्ति को मापने. निम्नलिखित प्रोटोकॉल दोनों विट्रो में और vivo मेंआंतों उपकला पारगम्यता का आकलन करने के लिए दो सरल तरीकों का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । कएको छैन-2BBe (ब्रश सीमा-व्यक्त) कोशिकाओं को हमेशा के लिए उपयोग किया जाता है तेर माप, ब्रश की अभिव्यक्ति के लिए कएको छैन-2 सेल लाइन से चयनित-सीमा प्रोटीन । कएको छैन-2BBe कोश?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ Jerrold आर टर्नर, ब्रिघम और महिला अस्पताल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल से, इस अध्ययन को पूरा करने में उनकी उदार मदद के लिए धंयवाद । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (अनुदान संख्या ८१४७०८०४, ३१४०१२२९, और ८१२००६२०), Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या BK20180838, और BK20140319), के लिए अनुसंधान नवाचार कार्यक्रम Jiangsu प्रांत के कॉलेज स्नातकों (अनुदान संख्या KYLX16-0116), Soochow विश्वविद्यालय के उंनत अनुसंधान परियोजनाओं (अनुदान संख्या SDY2015_06), और Crohn और कोलाइटिस फाउंडेशन रिसर्च फेलोशिप पुरस्कार (अनुदान संख्या ३१०८०१) ।
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
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