في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية
Summary
أسلوبي ترد هنا لتحديد وظيفة الحاجز المعوي. مقياس الظهارية (فولت/أوم) يستخدم لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال من ابيثيليا مثقف مباشرة في الآبار زراعة الأنسجة. في الفئران، يتم استخدام الأسلوب تزقيمية فيتك-ديكستران لتحديد نفاذية الأمعاء في الجسم الحي.
Abstract
الحاجز المعوي يدافع ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض، والسمية الجرثومية. ينظم وظيفتها نفاذية مفرق ضيق وسلامة الخلايا الظهارية، وتعطيل وظيفة جدار الأمعاء يسهم في تطور الأمراض المعدية المعوية والجهازية. أسلوبي بسيط يرد هنا لقياس نفاذية ظهارة الأمعاء. في المختبر، يتم مطلي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم في الآبار زراعة الأنسجة كأحادي الطبقة والمقاومة الكهربائية ترانسيبيثيليال (ثالثا) يمكن أن تقاس بمقياس الظهارية (فولت/أوم). هذا الأسلوب مقنع بسبب عملية سهلة الاستعمال والتكرار. الفئران الحية، جافاجيد مع 4 كاتشين fluorescein isothiocyanate (فيتك)-يتم قياس تركيزات فيتك-ديكستران ديكستران وفي عينات مصل الدم التي تم جمعها من الفئران لتحديد نفاذية الظهارية. تزقيمية شفوي يقدم جرعة دقيقة، وذلك هو الأسلوب المفضل لقياس النفاذية المعوية في فيفو. أخذت معا، هاتين الطريقتين يمكن قياس النفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفو، ومن ثم استخدامها لدراسة العلاقة بين الأمراض ووظيفة الحاجز.
Introduction
الخلايا الظهارية المعوية ليست مسؤولة عن امتصاص المواد المغذية فحسب، ولكن أيضا تشكل عائقا هاما الدفاع عن نفسه ضد الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض والسموم الميكروبية. وينظم هذه الدالة الحاجز المعوي نفاذية مفرق ضيق والخلايا الظهارية سلامة1،،من23، والخلل الوظيفي لوظيفة الحاجز الظهارية يرتبط مع التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين). خاتم أكتوميوسين بيريجونكشونال (PAMR) تقع داخل الخلية غير متجاورة عن كثب للوصلات ضيق. تقلص PAMR، الذي ينظمه في سلسلة الميوسين الخفيفة (حركة تحرير الكونغو)، أمر حاسم لتنظيم مفرق ضيق نفاذية4،5،6،،من78، 9،10. عامل نخر الورم (تنف) أمر أساسي لفقدان جدار الأمعاء بحركة تحرير الكونغو الظهارية المعوية أوبريجولاتينج كيناز (ملكك) التعبير وحمل أوككلودين استيعاب11،،من1213.
يمكن عبور أيونات مثل Na+ و Cl– الفضاء باراسيلولار ب مسار المسامية أو تسرب14. في ظهارة “راشح”، تعكس التغييرات في تير أساسا مفرق ضيق تغيير النفاذية. قياس مكررا ثانيا نهج الكهربية المستخدمة عادة لقياس النفاذية مفرق ضيق، أساسا إلى نا+ و Cl–، استناداً إلى المقاومة مونولاييرس الخلية. وأبلغ أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا الظهارية المعوية والرئوية الخلايا الظهارية، والخلايا البطانية الوعائية، للقياسات مكررا ثانيا. فوائد هذا الأسلوب هي أن القياسات ثالثا غير الغازية ويمكن استخدامها لرصد خلايا حية في الوقت الحقيقي. وباﻹضافة إلى ذلك، تقنية قياس تير مفيد ل الدراسات السمية المخدرات15.
كربونات الكالسيوم-2BBe الخلايا خلايا غدية القولون الظهارية البشرية مع هيكل ووظيفة مشابهة للخلايا الظهارية المعوية صغيرة متباينة: فعلى سبيل المثال، يكون هذه الخلايا زغيبات والأنزيمات المرتبطة بفرشاة صغيرة في الأمعاء الحدود. ولذلك، ومثقف 2BBe كربونات مونولاييرس تستخدم كنموذج في المختبر لاختبار وظيفة الحاجز.
في الفئران، إحدى الطرق لدراسة نفاذية الأمعاء باراسيلولار بقياس قدرة فيتك-ديكستران على عبور الدم من التجويف. وهكذا، يمكن تقييم نفاذية الأمعاء قبل جافاجينج فيتك-ديكستران مباشرة في الفئران وقياس الأسفار داخل الدم. البروتوكول التالية توضح هذه المقالة طريقتين بسيطة لتقييم نفاذية ظهارة الأمعاء في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. كربونات الكالسيوم-2BBe (فرشاة الحدود-وإذ يعرب عن) خلايا تستخدم دائماً لقياس تير، مختارة من خط خلية كربونات الكالسيوم-2 للتعبير عن البروتينات الفرشاة للحدود. تحتوي الخلايا 2BBe كربونات الكالسيوم من النمط الظاهري الاستيعابية الزوائد عند متباينة تم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور جيرولد R. تيرنر، من مستشفى بريغهام والنساء، مدرسة هارفارد الطبية، لمساعدته السخية في إتمام هذه الدراسة. هذا العمل معتمد من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81470804 و 31401229 و 81200620)، ومؤسسة العلوم الطبيعية من جيانغسو (المنحة رقم BK20180838 و BK20140319)، “البحوث الابتكار برنامج” ل خريجي كلية من مقاطعة جيانغسو (رقم المنحة KYLX16-0116)، متقدمة البحث المشاريع من سوشو جامعة (المنحة رقم SDY2015_06)، وكرون والتهاب القولون مؤسسة بحوث جائزة الزمالة (منح رقم 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
