In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit
Summary
Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.
Abstract
De intestinale barrière verdedigt tegen pathogene micro-organismen en microbiële toxine. De functie wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit en verstoring van de intestinale barrièrefunctie bijdraagt aan progressie van gastro-intestinale en systemische ziekte. Twee eenvoudige methoden worden hier beschreven voor het meten van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel. In vitro, Caco-2BBe cellen zijn verguld in weefselkweek wells als een enkelgelaagde en transepithelial elektrische weerstand (TER) kan worden gemeten door een epitheliale (volt/ohm) meter. Deze methode is overtuigend vanwege de gebruiksvriendelijke bediening en herhaalbaarheid. In vivo muizen zijn gavaged met 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran, en de FITC-dextran-concentraties worden gemeten in verzamelde serummonsters van muizen om de epitheliale permeabiliteit. Mondelinge maagsonde biedt een nauwkeurige dosering, en daarom is de geprefereerde methode voor het meten van de intestinale permeabiliteit in vivo. Samen genomen, deze twee methoden kunnen meten de permeabiliteit van het intestinaal epitheel in vitro en in vivo, en vandaar worden gebruikt bij het bestuderen van de verbinding tussen ziekten en barrièrefunctie.
Introduction
Intestinale epitheliale cellen zijn niet alleen verantwoordelijk voor de absorptie van voedingsstoffen, maar vormen ook een belangrijke barrière te verdedigen tegen de pathogene micro-organismen en microbiële toxines. Deze functie van de intestinale barrière wordt gereguleerd door de strakke junction permeabiliteit en epitheliale cel integriteit1,2,3, en dysfunctie van de epitheliale barrièrefunctie is geassocieerd met ontstoken darm ziekte (IBD). De perijunctional actomyosine ring (PAMR) ligt in de cel die zich nauw aaneengesloten aan de strakke kruispunten. De inkrimping van de PAMR, die wordt geregeld door de myosin lichtketting (MLC), is van cruciaal belang voor de regulering van strakke junction permeabiliteit4,5,6,7,8, 9,10. Tumornecrosefactor (TNF) staat centraal in de intestinale barrière verlies door upregulating intestinale epitheliale MLC kinase (MLCK) expressie en inducerende occludin internalisering11,–12,13.
Ionen zoals Na+ en Cl– kunnen kruisen de paracellular ruimte door de porie of lek route14. In een “lekke” epitheel weerspiegelen veranderingen in TER voornamelijk veranderde tight junction permeabiliteit. TER meting is een veelgebruikte elektrofysiologische aanpak te kwantificeren tight junction doorlatend zijn, vooral voor nb+ en Cl–, op basis van de impedantie van de cel monolayers. Diverse celtypen, met inbegrip van intestinale epitheliale cellen, pulmonale epitheliale cellen en vasculaire endotheliale cellen, zijn gemeld voor TER metingen. Voordelen van deze methode zijn dat TER metingen niet-invasief zijn en kunnen worden gebruikt om levende cellen in real-time controleren. De meettechniek TER is bovendien handig voor drug toxiciteit studies15.
CaCO-2BBe cellen zijn cellen van de menselijke epitheliale colorectal adenocarcinoom met een structuur en functie vergelijkbaar met de gedifferentieerde kleine intestinale epitheliale cellen: bijvoorbeeld, deze cellen hebben microvilli en enzymen die zijn gekoppeld aan kleine intestinale borstel grens. Daarom, gekweekte Caco-2BBe monolayers worden gebruikt als een in vitro model voor het testen van de barrièrefunctie.
Bij muizen is unidirectioneel om te studeren van intestinale paracellular permeabiliteit door het meten van het vermogen van FITC-dextran te steken van de lumen in het bloed. Zo kan de intestinale permeabiliteit door gavaging FITC-dextran direct in muizen en het meten van de fluorescentie in het bloed worden beoordeeld. Het volgende protocol worden twee eenvoudige methoden om te beoordelen van de permeabiliteit van het intestinaal epitheel beschreven zowel in vitro als in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. CaCO-2BBe (brush border-uitdrukken) cellen worden altijd gebruikt voor TER meting, geselecteerd uit de Caco-2 cellijn voor expressie van borstel-grens eiwitten. CaCO-2BBe cellen hebben een villosités absorberend fenotype als volledig-gesplitste (na ongeveer 3 weken voor cultuur na confluence)17. Het is noodzakelijk om te voorkomen dat besmetting tijdens de meting, en te steriliseren van de elektrode. Omdat de procedure niet-steriele is, all…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij Dr. Jerrold R. Turner, van Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, bedanken voor zijn genereuze hulp bij het voltooien van deze studie. Dit werk wordt ondersteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (subsidie nummer 81470804, 31401229 en 81200620), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer BK20180838 en BK20140319), The Research Program voor innovatie College afgestudeerden van de oostelijke provincie Jiangsu (subsidie nummer KYLX16-0116), Advanced Research projecten van Soochow Universiteit (subsidie nummer SDY2015_06), en ziekte van Crohn & Colitis Foundation Research Fellowship Award (verlenen nummer 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
