In Vitro och In Vivo -metoder för att fastställa tarmens epitelceller permeabilitet
Summary
Här presenteras två metoder för att fastställa intestinal barriärfunktion. En epitelial mätare (volt/ohm) används för mätningar av transepithelial elektriska motståndet av odlade epitel direkt i vävnadsodling brunnar. Hos möss används metoden FITC-dextran sondmatning att avgöra den intestinala permeabilitet i vivo.
Abstract
Tarmbarriären försvarar mot patogena mikroorganismer och mikrobiell toxin. Dess funktion regleras av åtsittande föreningspunkt permeabilitet och epitelceller integritet, och störningar i funktionen tarmbarriären bidrar till utvecklingen av gastrointestinala och systemisk sjukdom. Här presenteras två enkla metoder för att mäta genomträngligheten av intestinal epitel. In vitro, Caco-2BBe celler är klädd i vävnadsodling brunnar som en enskiktslager och transepithelial elektriska motstånd (TER) kan mätas genom en epitelial (volt/ohm) mätare. Denna metod är övertygande på grund av dess användarvänlighet och repeterbarhet. In vivo möss är gavaged med 4 kDa fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-dextran och FITC-dextran koncentrationerna mäts i insamlade serumprover från möss till avgöra epitelial permeabilitet. Oral sondmatning ger en korrekt dos, och därför är den rekommenderade metoden att mäta av intestinal permeabilitet i vivo. Sammantaget dessa två metoder kan mäta genomträngligheten av intestinal epitel in vitro och in-vivo, och därmed användas för att studera kopplingen mellan sjukdomar och barriärfunktion.
Introduction
Tarmepitelceller ansvarar inte bara för absorption av näringsämnen, men utgör också ett viktigt hinder att försvara mot patogena mikroorganismer och mikrobiell gifter. Detta intestinal barriärfunktion regleras av åtsittande föreningspunkt permeabilitet och epitelceller integritet1,2,3, och dysfunktion av epitelial barriärfunktionen är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD). Perijunctional actomyosin ringen (PAMR) ligger inom cellen som är nära sammanhängande till de åtsittande föreningspunkterna. Sammandragning av den PAMR, som regleras av myosin lätta kedjan (MLC), är avgörande för reglering av åtsittande föreningspunkt permeabilitet4,5,6,7,8, 9,10. Tumörnekrosfaktor (TNF) är central för tarmbarriären förlust av upregulating intestinal epitelial MLC kinase (MLCK) uttryck och förmå occludin internalisering11,12,13.
Joner som Na+ och Cl– kan passera paracellular utrymmet av antingen pore eller läcka väg14. I en ”läckande” epitel återspeglar förändringar i TER primärt förändrade åtsittande föreningspunkt permeabilitet. TER mätning är en vanligt förekommande elektrofysiologiska strategi att kvantifiera åtsittande föreningspunkt permeabilitet, primärt till Na+ och Cl–, baserat på impedansen i cell enskiktslager. Olika celltyper, däribland tarmepitelceller, pulmonell epitelceller och vaskulära endotelceller, har rapporterats för TER-mätningar. Fördelarna med denna metod är att TER-mätningar är icke-invasiv och kan användas för att övervaka levande celler i realtid. Dessutom är TER mätning tekniken användbar för drug toxicitet studier15.
Caco-2BBe celler är mänskliga epitelceller kolorektal adenocarcinom celler med en struktur och funktion liknande de differentierade små tarmepitelceller: till exempel dessa celler ha Mikrovilli och enzymer som är associerad med liten intestinal borste gränsen. Därför utnyttjas odlade Caco-2BBe enskiktslager som en in vitro- modell för testning barriärfunktion.
Hos möss är ett sätt att studera intestinal paracellular permeabilitet genom att mäta FITC-dextran förmåga att korsa från lumen in i blodet. Intestinal permeabilitet kan således bedömas av gavaging FITC-dextran direkt in möss och mäta fluorescensen i blodet. Följande protokoll beskriver två enkla metoder för att bedöma intestinal epitel permeabilitet både in vitro- och in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska steg i protokollet. Caco-2BBe (borste gränsen-uttryckande) celler används alltid för TER mätning, utvalda från Caco-2 cell raden för uttrycket borsten gränserna proteiner. Caco-2BBe celler har en villus absorptive fenotyp när fullt differentierade (efter ca 3 veckor av kultur efter sammanflödet)17. Det är nödvändigt att undvika kontaminering under mätningen, och att sterilisera elektroden. Eftersom förfarandet är icke-sterila, kan mätningar endast utföras …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Jerrold R. Turner, från Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, för hans generösa hjälp att slutföra denna studie. Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation Kina (licensnummer 81470804, 31401229 och 81200620), den naturvetenskapliga grunden av Jiangsu-provinsen (licensnummer BK20180838 och BK20140319), The Research Innovation Program för College utexaminerade i Jiangsu-provinsen (licensnummer KYLX16-0116), avancerade projekt av Soochow forskningsuniversitet (licensnummer SDY2015_06), och Crohns & kolit Foundation Research Fellowship Award (bevilja nummer 310801).
Materials
| 22G gavage needle | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Black 96-well plates for fluorescence | Fisher | 14-245-197A | |
| C57/B6 mice | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | ||
| Caco-2BBe cells | ATCC | CRL-2102 | |
| Dextran sulphate sodium | MP Biomedicals | 2160110 | |
| DMED with high glucose and sodium pyruvate | Hyclone | SH30243.01B | |
| Epithelial (Volt/Ohm) Meter | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| Ethanol | Sinopharm ChemicalReagent | 10009218 | |
| Falcon tube (15 mL) | Corning | 430791 | |
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | FV1000 | |
| Fluorometer | Biotek | Synergy 2 | |
| HBSS | 138 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl2, 25 mM glucose | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| Modular Tissue Embedding Center | Leica | EG1150H | |
| Serum collection tubes | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 flask | corning | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| Polycarbonate membranes (Transwell) | Costar | 3413 | |
| Pressure pump | AUTOSCIENCE | AP-9925 | |
| Rotary Microtomy | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Xylene | Sinopharm ChemicalReagent | 10023418 |
References
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
- Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
- Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
- Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
- Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
- Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
- He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
- He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
- Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
- Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
- Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
- Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
- Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).
