Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten
Summary
In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.
Abstract
Vaskuläre Leck oder Plasma Paravasation, hat eine Reihe von Ursachen, und möglicherweise eine schwerwiegende Folge oder Symptom einer entzündlichen Reaktion. Diese Studie kann letztlich führen zu neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Es ist wichtig, dass Forscher die richtigen Werkzeuge, einschließlich der besten Methoden zur Verfügung, für das Studium Plasma Extravasation. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll mit der Evans blauen Farbstoff Methode, für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse. Dieses Protokoll ist absichtlich einfach, so groß wie möglich, aber bietet hohe Datenqualität. Evans blauen Farbstoff wurde gewählt, vor allem weil es einfach für den durchschnittlichen Labor zu verwenden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, Hinweise und Unterstützung für die Hypothese, dass das Enzym Neprilysin das Gefäßsystem gegen Plasma Extravasation schützen kann. Jedoch kann dieses Protokoll experimentell eingesetzt und leicht abgestimmt für den Einsatz in anderen Stämme von Mäusen oder in anderen Arten, in vielen verschiedenen Organen oder Geweben, für Studien, die anderen Faktoren verbunden, die wichtig zu verstehen sein können, zu verhindern oder zu behandeln sind Plasma Extravasation. Dieses Protokoll wurde umfassend optimiert und modifiziert von bestehenden Protokolle und vereint Zuverlässigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Wirtschaft, und allgemeine Verfügbarkeit von Material und Ausrüstung, machen dieses Protokoll überlegen für die durchschnittliche Labor in verwenden Quantifizierung der Plasma Extravasation von Organen.
Introduction
Vaskuläre Leck in den Organen bezieht sich auf Paravasation, oder Austritt von Blutplasma durch Lücken in dem Endothel der produziert nach Kapillare Venolen in den Organen. Dieses Plasma Extravasation oder erhöhten vaskulären Permeabilität, die an irgendeiner Art von einer entzündlichen Reaktion entstehen, kann schwerwiegende Folgen haben. So ist es wichtig, dass dieses Phänomen, seine Ursachen, Modulatoren und folgen, sind studiert und verstanden, und ebenso, dass Ermittler gute tools und Protokolle, um sie zu studieren. Die endothelialen Lücken können über eine Reihe von Reizen hergestellt werden, aber in der Regel entstehen durch die Einwirkung von Peptid Neurotransmitter und/oder Tachykinins auf der gefäßendothelien. Die großen natürlich vorkommende Vermittler dieses Prozesses, führt zu erhöhten Plasma Paravasation, gehört die Undecapeptide Tachykinin Neuropeptid, Substanz P1.
Methoden zu untersuchen und vaskulären Permeabilität oder Plasma Paravasation, Messen, die die albuminbindung Eigenschaft von Evans blauen Farbstoff verwenden, sind entwickelt worden, und sind in der Regel bekannt für ihre Genauigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Sicherheit und Möglichkeit, dass die Bestimmung des Plasma Extravasation aus mehreren Geweben auf einmal wenn ja gewünscht2,3,4,5,6,7,8,9 . Dieses Evans blau-Protokoll für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen von FVBN Mäusen verwendet alle diese, aber fügt einige wichtigen Änderungen, mit denen es in der Regel nützlich und anpassungsfähig für zukünftige Studien, mit durchschnittlichen Labor, das führt oder wird Führen Sie wichtige Studien der Faktoren im Zusammenhang mit Plasma Extravasation oder vaskulären Permeabilität. In diesem Protokoll ist Substanz P, die Mäuse bei 1 Nmol/kg, eingeführt, die die Extravasation des Plasmas durch 1.5-fold ergänzt. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Protokolls, woraus leichter beobachtbar und erhältlich resultiert. Andere Faktoren, die Einfluss auf Durchlässigkeit, wie verschiedene andere Peptide, Chemikalien oder einige Formen von toxischen Verletzungen oder verwendet werden können von anderen Labors, wie gewünscht untersucht. Halsschlagader-Injektionen werden in diesem Protokoll systemisch, einzuführen Evans blau und Substanz P verwendet, die terminal Operation erfordert. Halsschlagader Injektionen5,7,10, sind auch nach Berücksichtigung der erforderlichen terminal Operationstechniken jedoch einfacher zu meistern und führen zur Produktion von konsistentere Ergebnisse als andere venöse Injektionen, Schwanz Vene Spritzen4,9. Obwohl es für Evans blau von Retro-Orbital venösen Sinus-Injektionen zu liefernden möglich sind, wurden keine Hinweise in der Literatur gefunden, dass diese Art der Lieferung von Evans blau verwenden. Das hohe Maß an Expertise und Praxis reproduzierbar beherrschen diese Technik stark begrenzt jedoch wie bei Heck-Vene-Injektionen, seine Verwendung für erfolgreiche Evans blau-Injektionen. Im Gegensatz dazu bietet die alternative Halsschlagader Injektionsverfahren wie in unserem Protokoll beschrieben eine technisch erhältlich Lösung. Ein entscheidender Verfahren zur Perfusion der Maus Venen durchgeführt nur, nachdem das Opfer der Evans blau durchblutet Maus, entfernt überschüssige Evans blau färben und hat in diesem Protokoll standardisiert worden. Zuvor beschriebene Methoden der Perfusion wurden sorgfältig geprüft und geändert, um das vorliegende Verfahren zu erhalten. Andere Modifikationen, die hier beschrieben sind alle optimierten, unkompliziert und kostengünstig.
Es gibt einige wichtigeren Einschränkungen der Evans-blauer Farbstoff-Methode. Geringer Empfindlichkeit, manchmal verbunden mit dieser Methode kann beispielsweise einige grobe pathologischen und histologischen Zusatzprüfung von Geweben aus Evans blau injiziert Tiere verhindern. Diese und andere Einschränkungen führten jedoch zur Entwicklung von alternativen Methoden und Modelle, die jedoch nach wie vor Evans blau verwenden. Die Messung von Evans blau durch Fluoreszenz (und nicht von Visual-Palette) Spektroskopie kann erhöhen die Empfindlichkeit der Methode. Darüber hinaus war Fluoreszenzmikroskopie Evans blau gefärbten Gewebe entwickelt, damit für die Beobachtung der vaskulären Leck in deutlicher Standorte11. Auch Ganzkörper-imaging und Scannen von einem lebenden Tier zuvor mit Evans blau12 ermöglicht die Untersuchung von Evans blau Konzentrationen in kontinuierlicher Weise injiziert, anstatt an einer gewählten Zeit Punkt des Experiments. Allerdings ist diese Methode erfordert die Verfügbarkeit von geeigneten bildgebenden Einrichtungen, und kann sehr teuer sein. Änderungen bei Evans blau und in einem in Vitro Modell durchgeführt, haben wie z. B. in einer Zelle Kultur oder Küken chorioallantoic Modell13 (CAM) auch beschrieben worden. Diese Modelle werden durch Fluoreszenz und intravitalen14 Mikroskopie, überwacht und erlauben die Quantifizierung der vaskulären Permeabilität Veränderungen im Laufe der Zeit aber können werfen Fragen nach präzise Modellierung der in Vivo -Bedingungen und möglicherweise auch teuer.
Es wurden andere Methoden entwickelt, um zu bestimmen und zu quantifizieren, vaskuläre Leck oder Durchlässigkeit, die nicht die Verwaltung von Evans blau beinhalten. Diese Methoden können eine geeignete fluoreszierendes Molekül (z. B. Albumin oder Fluorescein) oder ein isotopisch beschriftete oder anderweitig tagged Molekül, Tiere Leben beschäftigen (oder um Zell-Kultur oder chorioallantoic (CAM) Modelle13, gefolgt von nicht-invasive Bildgebung (PET-Scanning, MRI, intravitalen Mikroskopie, ganze Körper-Scan) oder durch invasive Bildgebung (Fluoreszenz-Mikroskopie)3,12,15. Obwohl diese Techniken eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Evans blau Methoden anbieten können, haben sie auch Nachteile, die ihre erhebliche Komplexität, erforderliche Know-how, Ressourcen und hohen monetären Kosten beinhalten können.
Neprilysin16 (Peptidase Enzyms NEP, auch bekannt als CD10, MME oder Enkephalinase) ist vorgeschlagen worden, zu beteiligen, Hemmung der Plasma Paravasation, mindestens im Teil, durch die enzymatischen Metabolismus und Inaktivierung von endogene Substanz p. In Geweben, in denen die Zelle Oberfläche Peptidase NEP auftritt, kann es also eine Abschwächung der Wirkung der Substanz P, vermutlich durch die Peptidase Aktivität der NEP
Zunächst haben wir für die Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Nutzung dieses modifizierte Evans blau-Protokoll mit FVBN Wildtyp (WT) und NEP-Knockout (KO)-Mäusen getestet. NEP Beteiligung an Substanz P-augmented Plasma Extravasation wurde aus diesen anfänglichen Studien vermutet, und wir beschreiben diese und weitere Experimente mit NEP Rolle im Plasma Extravasation. Im Mittelpunkt dieser Handschrift ist nicht NEP oder seiner Rolle im Plasma Paravasation, allerdings eher die Plasma Extravasation Experimente selbst. Die NEP-Ergebnisse sind repräsentativ für die Art der Ergebnisse, die durch Einsatz des modifizierten Protokolls erzielt werden können. Die Evans blau-Methode zur Messung der Plasma Extravasation wurden optimiert und verändert, wie im Detail unten für FVBN Mäuse beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie oben besprochen, kann das Studium der Plasma Extravasation letztlich neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder führen neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Der erfolgreiche Einsatz des Protokolls Plasma Extravasation (oben), wurde mit Evans blau färben, im aktuellen Manuskript nachgewiesen. Obwohl die gezeigten Daten wieder die Hypothese, dass NEP kann das Gefäßsystem schützen gegen Plasma Paravasation, dies ist ein sekundäres Ziel derzeit mit dem primären Ziel, um ein optimiertes Pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren wollen Andy Poczobutt und Dr. Jori Leszczynski für ihre wertvolle Hilfe und Bearbeitungen dieses Manuskriptes danken. Unterstützt durch Zuschüsse aus den nationalen Herz-, Lungen- und Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 und RO3 HL095439) und das Department of Veterans Affairs (Verdienst Review).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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