माउस में संवहनी रिसाव का आकलन करने के लिए एक अनुकूलित इवांस ब्लू प्रोटोकॉल
Summary
इस अनुच्छेद में, एक किफायती, अनुकूलित, और सरल प्रोटोकॉल वर्णित है जो FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए इवांस ब्लू डाई विधि का उपयोग करता है कि अन्य उपभेदों, प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और अन्य अंगों या ऊतकों.
Abstract
संवहनी रिसाव, या प्लाज्मा extravasation, कारणों की एक संख्या है, और एक गंभीर परिणाम या एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लक्षण हो सकता है । इस अध्ययन के अंत में नए या नए तरीके को बाधित या प्लाज्मा extravasation के इलाज के कारणों के विषय में ज्ञान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह महत्वपूर्ण है कि शोधकर्ताओं ने प्लाज्मा extravasation का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध सर्वोत्तम तरीकों सहित उचित उपकरण, है । इस लेख में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन, इवांस ब्लू डाई विधि का उपयोग, FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल जानबूझकर सरल है, के रूप में महान के रूप में संभव के रूप में एक डिग्री है, लेकिन उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान करता है । इवांस ब्लू डाई मुख्य रूप से चुना गया है क्योंकि यह औसत प्रयोगशाला के लिए उपयोग करने के लिए आसान है. हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है सबूत और परिकल्पना है कि एंजाइम neprilysin प्लाज्मा extravasation के खिलाफ vasculature की रक्षा कर सकते है के लिए समर्थन प्रदान करते हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल प्रयोग किया जा सकता है और आसानी से चूहों के अंय उपभेदों में या अंय प्रजातियों में उपयोग के लिए अनुकूलित, कई विभिंन अंगों या ऊतकों में, अध्ययन के लिए जो अंय कारकों है कि समझ में महत्वपूर्ण है शामिल कर सकते हैं, को रोकने, या इलाज प्लाज्मा extravasation । इस प्रोटोकॉल को व्यापक रूप से अनुकूलित और मौजूदा प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है, और विश्वसनीयता को जोड़ती है, का उपयोग करें, अर्थव्यवस्था में आसानी, और सामग्री और उपकरणों की सामांय उपलब्धता, इस औसत प्रयोगशाला के लिए बेहतर बनाने के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग अंगों से प्लाज्मा extravasation को बढ़ाता है.
Introduction
अंगों में संवहनी रिसाव extravasation करने के लिए, या अंगों में पोस्ट केशिका venules के endothelium में उत्पादित अंतराल के माध्यम से रक्त प्लाज्मा के रिसाव को संदर्भित करता है । इस प्लाज्मा extravasation या वृद्धि हुई संवहनी पारगम्यता, जो एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के कुछ प्रकार से उत्पन्न हो सकती है, गंभीर परिणाम हो सकता है. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि इस घटना, इसके कारणों, मॉडुलन, और परिणाम, अध्ययन और समझ रहे हैं, और इसी तरह, कि जांचकर्ताओं अच्छा उपकरण और प्रोटोकॉल है जिसके साथ उंहें अध्ययन करने के लिए है । endothelial अंतराल उत्तेजनाओं की एक संख्या के माध्यम से उत्पादन किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर endothelia पर पेप्टाइड न्यूरोट्रांसमीटर और/या tachykinins की कार्रवाई द्वारा उत्पादित कर रहे हैं. इस प्रक्रिया है, जो बढ़ प्लाज्मा extravasation में परिणाम के प्रमुख स्वाभाविक रूप से होने वाली मध्यस्थों में से एक, undecapeptide tachykinin neuropeptide, पदार्थ पी1है ।
तरीकों की जांच करने के लिए और संवहनी पारगम्यता या प्लाज्मा extravasation, जो इवांस ब्लू डाई के एल्ब्युमिन-बाध्यकारी संपत्ति का उपयोग करें, विकसित किया गया है, और आमतौर पर उनके सटीकता, सादगी, अर्थव्यवस्था, सुरक्षा के लिए जाना जाता है, और की अनुमति देने की क्षमता एक बार में कई ऊतकों से प्लाज्मा extravasation का निर्धारण, यदि ऐसा है तो वांछित2,3,4,5,6,7,8,9 . FVBN चूहों के अंगों में प्लाज्मा extravasation का आकलन करने के लिए यह इवांस ब्लू प्रोटोकॉल इन सभी का उपयोग करता है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण संशोधनों कि यह आम तौर पर उपयोगी और भविष्य के अध्ययन के लिए अनुकूल बनाने कहते हैं, औसत प्रयोगशाला है कि आयोजित या होगा शामिल प्लाज्मा extravasation या संवहनी पारगम्यता के साथ जुड़े कारकों की महत्वपूर्ण अध्ययन आचरण. इस प्रोटोकॉल में, पदार्थ पी 1 nmol/kg पर चूहों को पेश किया गया है, जो १.५-गुना तक प्लाज्मा के extravasation को संवर्धित करते हैं । इस प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, और अधिक आसानी से चौकस और प्राप्य परिणाम में जिसके परिणामस्वरूप । अंय कारकों है कि इस तरह के विभिंन अंय पेप्टाइड्स, रसायनों, या विषाक्त चोट के कुछ रूपों के रूप में पारगम्यता प्रभाव, इस्तेमाल किया जा सकता है या अंय प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन, के रूप में वांछित । Jugular नस इंजेक्शन इवांस नीले और पदार्थ पी प्रणालीबद्ध, जो टर्मिनल सर्जरी की आवश्यकता है परिचय करने के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । हालांकि, jugular नस इंजेक्शन5,7,10, यहां तक कि आवश्यक टर्मिनल शल्य चिकित्सा तकनीकों के विचार के बाद, मास्टर करने के लिए आसान कर रहे हैं और अन्य की तुलना में अधिक सुसंगत परिणाम के उत्पादन के लिए नेतृत्व पूंछ नस इंजेक्शन सहित शिरापरक इंजेक्शन,4,9. हालांकि यह इवांस नीले रेट्रो कक्षीय शिरापरक साइनस इंजेक्शन द्वारा दिया जा करने के लिए संभव हो सकता है, साहित्य में कोई संदर्भ नहीं पाया गया है कि इवांस नीले रंग की डिलीवरी के इस विधि का उपयोग करें । हालांकि, पूंछ नस इंजेक्शन के लिए के रूप में, विशेषज्ञता और अभ्यास के उच्च डिग्री reproducibly मास्टर इस तकनीक को बहुत सफल इवांस ब्लू इंजेक्शन के लिए इसके उपयोग की सीमा । इसके विपरीत, वैकल्पिक jugular नस इंजेक्शन विधि के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित है, एक तकनीकी रूप से प्राप्य समाधान प्रदान करता है । माउस की नसों के छिड़काव के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया, इवांस ब्लू-perfused माउस के बलिदान के बाद प्रदर्शन किया, अतिरिक्त इवांस ब्लू डाई निकालता है, और इस प्रोटोकॉल में मानकीकृत किया गया है. पहले छिड़काव के तरीकों का वर्णन किया गया है ध्यान से जांच की और वर्तमान प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए संशोधित । अंय संशोधनों यहां वर्णित सभी अनुकूलित कर रहे हैं, सीधा, और सस्ती ।
वहां इवांस ब्लू डाई विधि की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । उदाहरण के लिए, इस विधि के साथ जुड़े कम संवेदनशीलता कभी कुछ अतिरिक्त सकल रोग और ऊतकवैज्ञानिक इवांस ब्लू इंजेक्शन जानवरों से ऊतकों की परीक्षा को रोक सकता है । हालांकि, इन और अंय सीमाओं वैकल्पिक तरीकों और मॉडलों के विकास के लिए नेतृत्व किया है कि, फिर भी, इवांस ब्लू का उपयोग करें । प्रतिदीप्ति द्वारा इवांस ब्लू की माप (बजाय दृश्य-रेंज द्वारा) स्पेक्ट्रोस्कोपी विधि की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं. इसके अतिरिक्त, इवांस नीले दाग ऊतकों के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और अधिक विशिष्ट11स्थानों में संवहनी रिसाव के अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था । इसके अलावा, पूरे शरीर इमेजिंग और एक जीवित जानवर पहले इवांस ब्लू12 के साथ इंजेक्शन की स्कैनिंग एक सतत तरीके से इवांस नीले सांद्रता की जांच के लिए अनुमति देता है, बजाय प्रयोग के एक विशिष्ट चुना समय बिंदु पर । हालांकि, इस विधि उचित इमेजिंग सुविधाओं की उपलब्धता की आवश्यकता है, और बहुत महंगा हो सकता है । इवांस ब्लू शामिल संशोधन और मॉडल के इन विट्रो प्रकार में प्रदर्शन किया, जैसे एक सेल संस्कृति या लड़की chorioallantoic मॉडल13 (सांचा) में भी वर्णित किया गया है । इन मॉडलों प्रतिदीप्ति और intravital14 माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी कर रहे हैं, और समय के साथ संवहनी पारगम्यता परिवर्तन के ठहराव अनुमति देते हैं, लेकिन vivo स्थितियों में की सटीक मॉडलिंग के बारे में सवाल उठा सकते हैं और यह भी हो सकता है महंगे.
वहाँ अन्य तरीकों का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है और संवहनी रिसाव या पारगम्यता, जो इवांस ब्लू के प्रशासन को शामिल नहीं है. इन तरीकों (जैसे एल्ब्युमिन या fluorescein के रूप में), या एक isotopically लेबल या अंयथा अणु टैग के रूप में एक उचित फ्लोरोसेंट अणु को रोजगार कर सकते हैं, जानवरों (या सेल संस्कृति या chorioallantoic (सांचा)13मॉडल, गैर इनवेसिव द्वारा पीछा इमेजिंग (पीईटी स्कैनिंग, एमआरआई, intravital माइक्रोस्कोपी, पूरे शरीर स्कैनिंग) या इनवेसिव इमेजिंग द्वारा (फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी)3,12,15. हालांकि इन तकनीकों अंय इवांस नीले तरीकों पर लाभ के एक नंबर की पेशकश कर सकते हैं, वे भी नुकसान है, जो उनके काफी जटिलताओं, अपेक्षित विशेषज्ञता, संसाधनों, और उच्च मौद्रिक लागत शामिल हो सकते हैं ।
16 Neprilysin (peptidase एंजाइम नेप, भी CD10, MME, या Enkephalinase के रूप में जाना जाता है) के लिए प्लाज्मा extravasation बाधा में शामिल होने का सुझाव दिया गया है, कम भाग में, एंजाइमी चयापचय और अंतर्जात पदार्थ पी की निष्क्रियता के माध्यम से । इस प्रकार, ऊतकों में जो कोशिका सतह peptidase नेप होता है, वहां नेप के peptidase गतिविधि द्वारा संभवतः पदार्थ पी के प्रभाव के एक क्षीणन हो सकता है ।
शुरू में, हम पदार्थ पी प्रेरित प्लाज्मा extravasation FVBN जंगली प्रकार (WT) और नेप नॉकआउट (KO) चूहों के साथ, इस संशोधित इवांस ब्लू प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए परीक्षण किया । पदार्थ पी में नेप भागीदारी-संवर्धित प्लाज्मा extravasation इन प्रारंभिक अध्ययन से संदिग्ध था, और हम इन और आगे प्लाज्मा extravasation में नेप भूमिका शामिल प्रयोगों का वर्णन । हालांकि, इस पांडुलिपि का ध्यान नेप या प्लाज्मा extravasation में अपनी भूमिका नहीं है, बल्कि प्लाज्मा extravasation स्वयं प्रयोगों । नेप परिणाम परिणाम है कि इस संशोधित प्रोटोकॉल के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है की तरह के प्रतिनिधि हैं । इवांस ब्लू विधि प्लाज्मा extravasation को मापने के लिए अनुकूलित और संशोधित किया गया है, FVBN चूहों के लिए नीचे विस्तार में वर्णित के रूप में.
Protocol
Representative Results
Discussion
के रूप में ऊपर चर्चा की, प्लाज्मा extravasation के अध्ययन अंततः नए के कारणों या नए तरीके को बाधित या प्लाज्मा extravasation के इलाज के विषय में ज्ञान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्लाज्मा extravasation प्रोटोकॉल के सफल प्रयोग (ऊपर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को अपनी बहुमूल्य मदद और इस पांडुलिपि को संपादन के लिए एंडी Poczobutt और डॉ जोरी Leszczynski शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 और RO3 HL095439) और ‘ ‘ दिग्गजों मामलों के विभाग (योग्यता समीक्षा) से प्राप्त अनुदान द्वारा समर्थित ।
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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