En optimalisert Evans blå protokollen å vurdere vaskulær lekkasje i musen
Summary
I denne artikkelen er en økonomisk, optimalisert og enkel protokoll beskrevet som bruker metoden Evans blått fargestoff for å vurdere plasma bloduttredelse i organer av FVBN mus som kan tilpasses for bruk i andre stammer, arter, og andre organer eller vev.
Abstract
Vaskulær lekkasje eller plasma bloduttredelse, har en rekke årsaker, og kan være et alvorlig konsekvens eller symptom på en betennelsesreaksjon. Denne studien kan til slutt føre til ny kunnskap om årsakene til eller nye måter å hemme eller behandle plasma bloduttredelse. Det er viktig at forskere har de riktige verktøyene, inkludert de beste metodene tilgjengelige, for å studere plasma bloduttredelse. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll, med metoden Evans blått fargestoff for å vurdere plasma bloduttredelse i organer av FVBN mus. Denne protokollen er forsettlig enkelt, å like stor grad mulig, gir men høy kvalitet. Evans blått fargestoff er valgt hovedsakelig fordi det er lett for gjennomsnittlig laboratoriet bruke. Vi har brukt denne protokollen for å gi bevis og støtte for hypotesen at enzymet neprilysin kan beskytte blodkar mot plasma bloduttredelse. Men kan denne protokollen eksperimentelt brukt og lett tilpasses for bruk i andre stammer mus eller andre arter, i mange ulike organer eller vev, for studier som kan involvere andre faktorer som er viktige i forståelse, forebygge eller behandle plasma bloduttredelse. Denne protokollen er mye optimalisert og endret fra eksisterende protokoller og kombinerer pålitelighet, lette, økonomi, og generell tilgjengelighet av materialer og utstyr, som gjør denne protokollen overlegen for gjennomsnittlig laboratoriet til bruk i kvantifisere plasma bloduttredelse av organer.
Introduction
Vaskulær lekkasje i organer refererer til bloduttredelse eller lekkasje av blod plasma gjennom hullene produsert i endotelet av post kapillært venules i organer. Dette plasma bloduttredelse eller økt vaskulær permeabilitet, som kan oppstå fra noen form for en inflammatorisk respons, kan ha alvorlige konsekvenser. Det er derfor viktig at dette fenomenet, årsaker, modulatorer og konsekvenser, er studert og forstått, og likeledes at etterforskerne har gode verktøy og protokoller som å studere dem. Endothelial hullene kan produseres via en rekke stimuli, men vanligvis er produsert av peptid nevrotransmittere og/eller tachykinins på endothelia. En av stor naturlig forekommende meklere av denne prosessen, som resulterer i økt plasma bloduttredelse, er den undecapeptide tachykinin neuropeptide, substans P1.
Metoder for å undersøke og måle vaskulær permeabilitet eller plasma bloduttredelse, som bruker egenskapen albumin bindende Evans blått fargestoff, har blitt utviklet, og er vanligvis kjent for deres nøyaktighet, enkelhet, økonomi, miljø og muligheten til den fastsettelse av plasma bloduttredelse fra flere vev samtidig, ønsket så2,3,4,5,6,7,8,9 . Denne Evans blå protokollen for å vurdere plasma bloduttredelse i organer av FVBN mus bruker alle disse, men legger noen viktige modifikasjoner som gjør det vanligvis nyttig og tilpasningsdyktig for fremtidige studier, med gjennomsnittlig laboratoriet som utfører eller vil utføre viktige studier av faktorer assosiert med plasma bloduttredelse eller vaskulær permeabilitet. I denne protokollen introdusert substans P til mus på 1 nmol/kg, som forsterker bloduttredelse plasma av 1.5-fold. Dette øker følsomheten av protokollen, resultere i lettere observerbare og oppnåelig resultater. Andre faktorer som påvirker permeabilitet, som ulike andre peptider, kjemikalier eller noen former for giftige skade, kan brukes eller studert av andre laboratorier, som ønsket. Vena jugularis injeksjoner brukes i denne protokollen å innføre Evans blå og substans P systemisk, som krever terminal kirurgi. Men er vena jugularis injeksjoner5,7,10, selv etter vurdering av de nødvendige terminal kirurgiske teknikkene, lettere å mestre og føre til produksjon av mer enhetlige resultater enn andre venøse injeksjoner, inkludert halen vene injeksjoner4,9. Selv om det kan være mulig for Evans blå leveres av retro-orbital venøs sinus injeksjoner, har ingen referanser i litteraturen blitt funnet som bruker denne leveringsmåten Evans blå. Men som for hale blodåre injeksjoner begrenser høye grad av kompetanse og praksis å mestre reproduserbar denne teknikken sterkt bruken for vellykket Evans blå injeksjoner. Derimot tilbyr alternativ vena jugularis injeksjon metoden som beskrevet i våre protokollen, en teknisk oppnåelig løsning. Viktig fremgangsmåte for perfusjon av musen er årer, utført rett etter at offer Evans blå-perfused musen, fjerner overflødig Evans blå farge, og blitt standardisert i denne protokollen. Tidligere beskrevet metoder av perfusjon er nøye undersøkt og endret for å få den nåværende prosedyren. Andre endringer beskrevet her er alle optimalisert, enkel og rimelig.
Det er noen viktige begrensninger av metoden Evans blå farge. Lav følsomhet med denne metoden kan for eksempel hindre noen ekstra brutto patologiske og histologiske undersøkelse av vev fra Evans blå-injisert dyr. Men har disse og andre begrensninger ført til utvikling av alternative metoder og modeller som, likevel fortsatt bruker Evans blå. Måling av Evans blå av fluorescens (i stedet for visual-range) spektroskopi kan øke sensitiviteten av metoden. I tillegg ble fluorescens mikroskopi Evans blå-farget vev utviklet for observasjon av vaskulær lekkasje i flere forskjellige steder11. Også hele kroppen imaging og skanning av levende dyr tidligere injisert med Evans blå12 tillater undersøkelse av Evans blå konsentrasjoner i en kontinuerlig måte, heller enn på spesielt valgt tid punkt av eksperimentet. Men denne metoden krever at riktig imaging anlegg, og kan være svært dyrt. Endringer som involverer Evans blå og utføres i en i vitro type modell, har som i en celle kultur eller dama chorioallantoic modell13 (CAM) også blitt beskrevet. Disse modellene er overvåket av fluorescens og intravital14 mikroskopi, og tillater kvantifisering av vaskulær permeabilitet endringer over tid, men kan reises spørsmål om nøyaktig modellering i vivo betingelser og kan også være dyr.
Det har vært andre metoder utviklet for å fastslå og kvantifisere vaskulær lekkasje eller permeabilitet, som ikke involverer administrasjon av Evans blå. Disse metodene kan ansette en passende fluorescerende molekyl (som albumin eller fluorescein) eller en isotopically merket eller annet merket molekyl, å leve dyr (eller celle kultur eller chorioallantoic (CAM) modeller13, etterfulgt av ikke-invasiv Imaging (PET skanning, MRI, intravital mikroskopi, hele kroppen skanning) eller invasiv imaging (fluorescerende mikroskopi)3,12,15. Selv om disse teknikkene kan tilby mange fordeler over andre Evans blå metoder, har de også ulemper, som kan inkludere deres betydelig kompleksiteten, nødvendige kompetanse, ressurser og høye monetære kostnadene.
Neprilysin16 (peptidase enzymet NEP, også kjent som CD10, MME eller Enkephalinase) har blitt foreslått for å være involvert i hemme plasma bloduttredelse, minst delvis gjennom enzymatisk metabolisme og inaktivering av endogene stoff P. Dermed i vev som cellen overflaten peptidase NEP oppstår, kan det være en demping av effekten av substans P, antagelig av den peptidase aktiviteten til NEP.
I utgangspunktet testet vi for substans P-indusert plasma bloduttredelse utnytte denne endrede Evans blå protokollen, med FVBN wild type (WT) og NEP knockout (KO) mus. NEP engasjement i substans P-utvidet plasma bloduttredelse var mistenkt fra disse innledende studier, og vi beskrive dette og ytterligere eksperimenter med NEP rolle i plasma bloduttredelse. Fokus for dette manuskriptet er ikke NEP eller dens rolle i plasma bloduttredelse, men heller plasma bloduttredelse eksperimenter selv. NEP resultatene er representant for hva slags resultater som kan oppnås gjennom bruk av denne endret protokollen. Metoden Evans blå måle plasma bloduttredelse er optimalisert og endret, som beskrevet i detalj nedenfor for FVBN mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som drøftet over, kan studiet av plasma bloduttredelse til slutt føre til ny kunnskap om årsakene til eller nye måter å hemme eller behandle plasma bloduttredelse. Vellykket bruk av plasma bloduttredelse protokollen (over), har bruke Evans blå farge, vist i gjeldende manuskriptet. Selv om dataene tilbake hypotesen at NEP kan beskytte er blodkar mot plasma bloduttredelse, dette er et sekundært mål, med det primære mål er å presentere en optimalisert protokoll som lett kan brukes i gjennomsnittlig laboratoriet f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Andy Poczobutt og Dr. Jori Leszczynski for verdifull hjelp og endringer i dette manuskriptet. Støttes av tilskudd fra nasjonale hjertet, lungene og blod Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 og RO3 HL095439) og Institutt for veteraner saker (fortjeneste Review).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
