Um otimizado Evans Blue protocolo para avaliar vazamento Vascular no Mouse
Summary
Neste artigo, um protocolo simples, econômico e otimizado é descrito que usa o método de corante azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN que pode ser adaptada para uso em outras cepas, espécies e outros órgãos ou tecidos.
Abstract
Vazamento vascular ou extravasamento de plasma, tem um número de causas e pode ser uma grave consequência ou sintoma de uma resposta inflamatória. Neste estudo, finalmente, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. É importante que os pesquisadores tenham as ferramentas apropriadas, incluindo os melhores métodos disponíveis, para estudar o extravasamento de plasma. Neste artigo, descrevemos um protocolo, usando o método do corante azul de Evans, para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN. Este protocolo é intencionalmente simples, para tão grande um grau possível, mas fornece dados de alta qualidade. Corante de azul de Evans foi escolhido principalmente porque é fácil para o laboratório de médio a usar. Usamos este protocolo para fornecer provas e suporte para a hipótese de que a enzima neprilysin que proteja a vasculatura contra extravasamento de plasma. No entanto, este protocolo pode ser usado experimentalmente e facilmente adaptado para uso em outras cepas de ratos ou em outras espécies, em muitos diferentes órgãos ou tecidos, para estudos, que pode envolver outros fatores que são importantes para a compreensão, prevenção ou tratamento de extravasamento de plasma. Este protocolo foi extensivamente otimizado e modificado de protocolos existentes e combina confiabilidade, facilidade de uso, economia e disponibilidade geral de materiais e equipamentos, fazendo com que este protocolo superior pelo laboratório média para uso em quantificando o extravasamento de plasma de órgãos.
Introduction
Vazamento vascular nos órgãos refere-se ao extravasamento, ou vazamento de plasma sanguíneo através de aberturas produzido no endotélio de pós capilares vênulas nos órgãos. Este extravasamento de plasma ou aumento da permeabilidade vascular, que pode decorrer de algum tipo de reacção inflamatória, pode ter graves consequências. Assim, é importante que este fenômeno, suas causas, moduladores e consequências, são estudadas e entendidas, e da mesma forma, que os investigadores têm boas ferramentas e protocolos com os quais a estudá-los. As lacunas endoteliais podem ser produzidas através de uma série de estímulos, mas geralmente são produzidas pela ação de neurotransmissores do peptide e/ou taquininas sobre o endothelia. Um dos principais mediadores naturais deste processo, o que resulta em extravasamento de plasma aumentado, é o undecapeptide tachykinin neuropeptide, substância P1.
Métodos para investigar e medir a permeabilidade vascular ou extravasamento de plasma, que usam a propriedade de ligação de albumina de corante azul de Evans, foram desenvolvidos e são geralmente conhecidos pela sua precisão, simplicidade, economia, segurança e capacidade de permitir que o determinação de extravasamento de plasma de vários tecidos ao mesmo tempo, se assim desejado2,3,4,5,6,7,,89 . Este protocolo de azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN usa todas essas, mas adiciona algumas importantes modificações que tornam geralmente útil e adaptável para futuros estudos, envolvendo o laboratório de médio que conduz ou será realizar estudos importantes de fatores associados com extravasamento de plasma ou a permeabilidade vascular. Neste protocolo, a substância P é introduzido aos ratos 1 nmol/kg, o que aumenta o extravasamento de plasma por 1.5-fold. Isto aumenta a sensibilidade do protocolo, resultando em resultados mais facilmente observáveis e alcançável. Outros fatores que afetam a permeabilidade, como vários outros peptídeos, substâncias químicas ou algumas formas de lesão tóxica, podem ser usados ou estudados por outros laboratórios, como desejado. Veia jugular injeções são utilizadas neste protocolo apresentar azul de Evans e substância P sistemicamente, que requer cirurgia terminal. No entanto, veia jugular injeções5,7,10, mesmo após a consideração das necessárias técnicas cirúrgicas terminais, são mais fáceis de dominar e levam à produção de resultados mais consistentes do que outro injeções venosas, incluindo a cauda veia injeções4,9. Embora seja possível para Evans azul ser entregue por injeções de seio venoso orbital retrô, não há referências na literatura foram encontradas que usam este método de entrega de azul de Evans. No entanto, quanto a injeções de veia da cauda, o alto grau de especialização e prática reproducibly dominar esta técnica extremamente limita seu uso para injeções bem sucedidas de azul de Evans. Em contraste, o método de injeção alternativa veia jugular, conforme descrito em nosso protocolo, oferece uma solução tecnicamente obtenível. Um procedimento crucial para perfusão das veias do rato, realizado logo após o sacrifício do rato azul-perfundidos Evans, remove o excesso corante azul de Evans e tem sido padronizado neste protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusão foram cuidadosamente examinados e modificados para obter o presente procedimento. Outras modificações aqui descritas são todos otimizada, simples e barato.
Existem algumas limitações importantes de método de corante azul de Evans. Por exemplo, baixa sensibilidade, às vezes associada com este método pode impedir alguns adicional bruta exame patológico e histológica de tecidos de animais injetado azul de Evans. No entanto, estas e outras limitações conduziram ao desenvolvimento de métodos alternativos e modelos que, não obstante, ainda usam azul de Evans. A medição de azul de Evans por fluorescência (em vez de alcance visual) espectroscopia pode aumentar a sensibilidade do método. Além disso, a microscopia de fluorescência dos tecidos manchadas de azul de Evans foi desenvolvida para permitir a observação de vazamento vascular nas mais distintas localidades11. Também, todo o corpo de imagem e digitalização de um animal vivo previamente injetaram com Evans azul12 permite a investigação das concentrações de azul de Evans de forma contínua, em vez de em um específico escolhido tempo momento do experimento. No entanto, este método requer a disponibilidade de instalações adequadas de imagem e pode ser muito caro. Modificações envolvendo Evans azul e executados em um tipo in vitro do modelo, como em uma célula de cultura ou garota corioalantoicas modelo13 (CAM) também foram descritos. Estes modelos são monitorados por fluorescência e microscopia intravital14 e permitam a quantificação de alterações de permeabilidade vascular ao longo do tempo, mas podem levantar questões sobre modelagem exata das condições na vivo e também podem ser caro.
Há outros métodos desenvolvidos para determinar e quantificar vazamento vascular ou permeabilidade, que não envolvem a administração de azul de Evans. Esses métodos podem empregar uma molécula fluorescente apropriada (como albumina ou fluoresceína), ou uma molécula etiquetada desvendar etiquetada ou não, de animais vivos (ou a célula cultura ou corioalantoicas (CAM) modelos13, seguido por não-invasiva Imaging (digitalização de PET, MRI, microscopia intravital, varredura de corpo inteiro) ou por invasivas de imagens (microscopia fluorescente)3,12,15. Embora essas técnicas podem oferecer um número de vantagens sobre outros Evans métodos azuis, eles também têm desvantagens, que podem incluir seus consideráveis complexidades, necessária experiência, recursos e elevados custos monetários.
Neprilysin16 (peptidase enzima NEP, também conhecido como CD10, MME ou Enkephalinase) foi sugerido para ser envolvido na inibição de extravasamento de plasma, pelo menos em parte, através do metabolismo enzimático e inactivação de p. de substância endógena Assim, nos tecidos em que ocorre o peptidase de superfície celular NEP, pode haver uma atenuação do efeito da substância P, presumivelmente pela atividade peptidase de NEP.
Inicialmente, nós testamos para extravasamento de plasma induzido por substância P, utilizando este protocolo modificado de azul de Evans, com FVBN selvagem tipo (WT) e ratos de NEP nocaute (KO). Envolvimento do NEP no extravasamento de plasma aumentada de substância P suspeitou-se destes estudos iniciais, e nós descrever estas experiências ainda mais o papel do NEP envolvendo em extravasamento de plasma. No entanto, não é o foco deste manuscrito NEP ou seu papel no extravasamento de plasma, mas prefiro o extravasamento de plasma experimentos próprios. Os resultados do NEP são representativos do tipo de resultados que podem ser obtidos através do uso do presente protocolo modificado. O método de azul de Evans para medir o extravasamento de plasma foi otimizado e modificado, conforme descrito em detalhe abaixo para os ratos FVBN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como discutido acima, o estudo de extravasamento de plasma em última análise, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. O uso bem sucedido do protocolo de extravasamento de plasma (acima), usando o corante azul de Evans, foi demonstrado no manuscrito atual. Embora os dados mostrados volta a hipótese que a NEP pode proteger a vasculatura contra extravasamento de plasma, este é um objetivo secundário atualmente, com o objetivo primário de apresent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Andy Poczobutt e Dr. Jori Leszczynski pela valiosa ajuda e edições para este manuscrito. Apoiado por subvenções recebidas do coração nacional, pulmão e sangue Institute (NHLBI RO1 HL078929, HL014985 de PPG e RO3 HL095439) e assuntos do departamento de veteranos (revisão de mérito).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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