Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования
Summary
Протокол для изоляции первичных микроглии из мышиных мозги представлены. Этот метод помогает в углублении нынешнего понимания Неврологические заболевания. Плотность градиентного центрифугирования и магнитной сепарации объединяются для получения достаточного урожая высоки чисто образца. Кроме того мы наметим шаги для характеризации микроглии.
Abstract
Микроглии, резидентов иммунные клетки в головном мозге, являются первыми реагируют воспаление или травмы в центральной нервной системе. Недавние исследования показали микроглии быть динамичной, способны взять на себя про воспалительных и противовоспалительным фенотипов. (Про воспалительных) М1 и м2 (pro репаративной) фенотипов играть важную роль в neuroinflammatory условиях, таких как перинатальной черепно-мозговой травмы и выставка различные функции в ответ на определенные экологические стимулы. Модуляция микроглии активации было отмечено придать нейропротекции, таким образом предлагая микроглии может иметь терапевтический потенциал в черепно-мозговой травмы. Однако дополнительные исследования необходимо лучше понять роль микроглии в болезни, и этот протокол облегчает что. Протокол описанных ниже сочетает плотность градиентного центрифугирования процесс уменьшения сотовой мусора, с магнитной сепарации, производить очень чистый образец первичных Микроглии клеток, которые могут использоваться для экспериментов в пробирке , без потребность в 2-3 недели культивирования. Кроме того характеристика шаги дают надежные функциональные данные о микроглии, пособничество исследования для улучшения нашего понимания поляризации и грунтовки этих клеток, которая имеет серьезные последствия в области регенеративной медицины.
Introduction
Ущерб, приобретенные в перинатальный период от воспаления, гипоксическая ишемия и кровотечение может иметь массив долгосрочных осложнений. Привлечь воспаления и ишемии с последовавшей смерти нейронов и аксональной1предположил комплекс патофизиологии перинатальной черепно-мозговой травмы. Врожденный иммунный ответ играет важную роль в каскад событий, приведших к травмы2.
Микроглии, резидентов иммунные клетки в пределах центральной нервной системы (ЦНС), являются первыми реагируют на травмы3. Микроглии являются типы пластиковых клеток с способность быть защитные или токсичными, зависит от окружающей среды4. Они участвуют в хемотаксис, фагоцитоз, презентации антигена и производство цитокинов и реактивнооксигенных видов4,5. Стареющей микроглии постоянно обследования окружающей среды и активируются присутствие иностранных или вредные вещества,4. Активация приводит к про воспалительной реакции, критические в ЦНС защиты4. Эти М1 «про воспалительных» фенотип микроглии главным образом участвуют в презентации антигена и гибель патогенов4. Несмотря на решающую роль воспалительной реакции в нейропротекции неконтролируемое или длительное воспаление может быть вредным и привести к повреждения нейронов4. Однако при воздействии определенных экологических раздражителей, микроглии могут exhibit противовоспалительные фенотип. Эти про репаративной микроглии м2 имеют решающую роль в заживление ран и ремонт6, освобождение ряда цитокинов и других растворимых медиаторов, что помощью воспаления, усиливают фагоцитоз и поощрять ремонт4, 7. роли микроглии разнообразны и включают вождения Олигодендроциты дифференциация во время ре миелинизации8, защищая нейроны во время истощения кислорода и глюкозы в ход модели9 и поощрение neurite нарост в травмы спинного мозга моделей10.
Изучение этих глиальных клеток представляет собой важный аспект в понимании и манипулирования ответ на neuroinflammation. Описывается протокол позволяет для дальнейшего расследования терапевтический потенциал микроглии модуляции в neuroinflammatory расстройств.
Модуляция микроглии активации к роли нейропротекторной наблюдается в диапазоне условий11,12,13. Таким образом улучшение нынешнего понимания и дальнейшего изучения модуляции микроглии активации является критическим, требующих использования различных моделей, включая в пробирке и в естественных условиях. В vitro исследования представляют собой важный инструмент из-за их большей эффективности, Нижняя стоимость и возможность исследовать популяции изолированных клеток.
Существует целый ряд протоколов, описанные в литературе для изоляции микроглии из мышиных мозги, вызов эффективно производить высокий урожай образца с хорошей жизнеспособность и высокой чистоты. Часто используемые методы изоляции первичных Микроглии являются магнитной сепарации и длительной тряски смешанные глиальных культур. Через личный опыт было установлено, что существует высокая степень сотовой мусора, который препятствовали столбце магнитные. Таким образом был использован следующий протокол, который включает в себя шаг градиентного центрифугирования Начальная плотность, следуют CD11b магнитной сепарации. Производить очень чистый образец в достаточном количестве был оптимизирован протокол, описанные ниже. Это выгодно из-за его высокой чистоты и короткий период времени — одно можно выполнения анализов в течение 2 дней без культуры для 2-3 недели. Этот протокол потенциально может быть адаптирована для изоляции первичных мышиных астроциты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроглии имеют способность быть про – и противовоспалительными, изменено на стимулы окружающей среды. Предыдущие исследования показали, что модуляции микроглии активации может придать нейропротекции. Их способность обеспечивать защиту нейронов и ремонт повреждений требует дополни?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
