Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren
Summary
Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.
Abstract
Microglia, de resident immune cellen in de hersenen, zijn de eerste responders aan ontsteking of een letsel in het centrale zenuwstelsel. Recent onderzoek heeft geopenbaard microglia als dynamische, staat van de veronderstelling dat zowel pro-inflammatoire en anti-inflammatoire fenotypen. Zowel M1 (pro-inflammatoire) en M2 (pro-herstellend) fenotypen spelen een belangrijke rol in neuroinflammatoire aandoeningen zoals perinatale hersenletsel en vertonen verschillende functies in reactie op bepaalde milieu stimuli. De modulering van de activering van het microglial is te verlenen neuroprotectie dus suggereren microglia wellicht therapeutisch potentieel in hersenletsel geconstateerd. Echter meer onderzoek nodig om de rol van microglia in de ziekte beter te begrijpen is, en dit protocol dat vergemakkelijkt. Het protocol beschreven hieronder combineert een dichtheid kleurovergang centrifugeren proces ter vermindering van de cellulaire puin, met magnetische scheiding, produceren een zeer zuiver voorbeeld van primaire microglial cellen die kunnen worden gebruikt voor in vitro experimenten, zonder de nodig voor 2-3 weken kweken. Bovendien, opbrengst de karakterisering stappen robuuste functionele gegevens over microglia, medeplichtigheid aan studies om beter ons begrip van de polarisatie en priming van deze cellen, die sterke implicaties op het gebied van regeneratieve geneeskunde heeft.
Introduction
Schade verworven in de perinatale periode van ontsteking, hypoxische-ischemie en bloedingen kan een matrix van lange termijn gevolgen hebben. De complexe pathofysiologie van perinatale hersenletsel is theorie ontsteking en ischemie met daaropvolgende neuronale en axonale dood1te betrekken. De aangeboren immuunrespons speelt een belangrijke rol in de opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot letsel2.
Microglia, de resident immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CNS), zijn de eerste responders aan schade3. Microglia zijn kunststof celtypes met het vermogen om zowel beschermende of giftig, afhankelijk van de milieu-4. Ze zijn betrokken bij chemotaxis, fagocytose, antigeen presentatie en productie van cytokines en reactieve zuurstof soorten4,5. Verouderend microglia voortdurend onderzoek van het milieu en worden geactiveerd door de aanwezigheid van een buitenlandse of schadelijke stof4. Activering leidt tot een pro-inflammatoire respons, kritische in CNS bescherming4. Deze M1 “pro-inflammatoire” fenotype microglia zijn vooral betrokken bij antigeen presentatie en dood van ziekteverwekkers4. Ondanks de cruciale rol van de inflammatoire respons in neuroprotectie kunnen ongecontroleerde of langdurige ontsteking schadelijke en leiden tot neuronale schade4. Echter wanneer blootgesteld aan bepaalde milieu stimuli, kan microglia vertonen een anti-inflammatoire fenotype. Deze pro-herstellend M2 microglia hebben een cruciale rol in de wondgenezing en het herstel van6, het vrijgeven van een reeks van cytokines en andere oplosbare bemiddelaars dat downregulate ontsteking, verhogen van fagocytose en bevorderen herstellen4, 7. de rol van microglia zijn divers en omvatten drijvende Oligodendrocyt differentiatie tijdens re-myelinisering8, bescherming van neuronen tijdens uitputting van zuurstof en glucose in lijn modellen9 en bevordering van neurite uitgroei in dwarslaesie modellen10.
De studie van deze gliale cellen vertegenwoordigt een belangrijk aspect in het begrip en het manipuleren van het antwoord op neuroinflammation. Het beschreven protocol voorziet in verdere onderzoek naar de therapeutische mogelijkheden van microglia modulatie in neuroinflammatoire aandoeningen.
De modulering van de activering van de microglial naar de rol van een neuroprotectieve geconstateerd in een aantal voorwaarden11,12,13. Dus, verbetering van de huidige kennis en verder studeren modulatie van de activering van het microglial is essentieel, waarbij het gebruik van diverse modellen, met inbegrip van zowel in vitro als in vivo. In vitro studies zijn een belangrijk instrument als gevolg van hun grotere efficiëntie, lagere kosten en de mogelijkheid te onderzoeken van een geïsoleerde-celpopulatie.
Er zijn een aantal protocollen die zijn beschreven in de literatuur voor de isolatie van microglia vanuit lymfkliertest brains, de uitdaging om een steekproef van hoge opbrengst efficiënt te produceren met goede levensvatbaarheid en hoge zuiverheid. Veelgebruikte methoden van isolatie van primaire microglia zijn door magnetische scheiding en langdurig schudden van gemengde gliale culturen. Door persoonlijke ervaring bleek dat er een hoge mate van cellulaire puin die belemmerd de magnetische kolom. Zo werd het volgende protocol gebruikt, waarin een oorspronkelijke dichtheid kleurovergang centrifugeren stap gevolgd door magnetische scheiding van CD11b. Het protocol die hieronder beschreven is geoptimaliseerd voor het produceren van zeer zuivere eenmonstervan in voldoende hoeveelheid. Het is gunstig als gevolg van de hoge zuiverheid en de korte periode — een testen binnen 2 dagen kunt uitvoeren zonder cultuur voor 2-3 weken. Dit protocol kan mogelijk worden aangepast voor de isolatie van primaire lymfkliertest astrocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia hebben de mogelijkheid om zowel pro- en anti-inflammatoire, gewijzigd door prikkels van de omgeving. Eerdere studies hebben aangetoond dat de modulatie van microglia activering neuroprotectie kan verlenen. Hun vermogen om te beveiligen neuronen en schade reparatie vereist meer onderzoek ter bevordering van de huidige kennis van deze complexe cellen. Isolatie van hoge zuiverheid primaire microglia is dus een belangrijke en nuttige techniek. Dit is een relatief snelle methode voor het verkrijgen van zeer zuivere …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
