특성화 및 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 마우스 기본 Microglia의 절연
Summary
기본 microglia murine 두뇌에서의 격리에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 이 기술은 신경 상황의 현재 이해를 발전에 에이즈. 조밀도 기온 변화도 원심 분리와 자력 분리 매우 순수한 샘플의 충분 한 수확량을 생산 하기 위해 결합 됩니다. 또한, 우리 microglia의 특성에 대 한 단계를 설명합니다.
Abstract
Microglia, 두뇌에 있는 면역 세포 염증 또는 중앙 신경 조직에 상해에 초 동 조치입니다. 최근 연구는 동적, 프로-염증 성 및 안티-염증 고기 가정 수 microglia를 밝혔다. 둘 다 (프로-염증 성) M1 및 M2 (프로) 고기 플레이 perinatal 뇌 손상 등 전시 다른 neuroinflammatory 조건에서 중요 한 역할은 특정 환경 자극에 대 한 응답에서 기능. Microglial 활성화의 변조는 따라서 microglia 뇌 손상에 치료 잠재력을 할 수 있습니다 제안 하는 neuroprotection 부여 하는 것 주의 되었다. 그러나, 더 많은 연구가 더 나은 microglia 질병에서의 역할을 이해 하는 데 필요한 이며이 프로토콜을 용이 하 게 한다. 프로토콜 아래에 설명 된 결합 밀도 그라데이션 원심 분리 과정에서 시험관 실험 없이 사용할 수 있는 기본 microglial 세포의 매우 순수한 샘플 생산 자력 분리와 세포 파편을 줄이기 위해는 2-3 주 배양에 대 한 필요 합니다. 또한, 특성화 단계 microglia, 분극의 우리의 이해를 더 나은 연구를 방 조 하 고 이러한 세포의 못쓰게는 재생 의학 분야에서 강한 영향에 대 한 강력한 기능 데이터를 얻을.
Introduction
염증, hypoxic 뇌 출혈에서 perinatal 기간 동안 손상 장기 sequelae의 배열을 가질 수 있습니다. Perinatal 뇌 손상의 복잡 한 이상 염증 그리고 이어지는 신경 및 axonal 죽음1허 혈 이론 이다. 타고 난 면역 반응 부상2로 이어지는 이벤트의 캐스케이드에 중요 한 역할을 한다.
Microglia, 중앙 신경 시스템 (CNS) 내 거주 면역 세포는 부상3초 동 조치. Microglia 용량4환경 보호 또는 독성, 종속을 가진 플라스틱 셀 종류가 있습니다. 그들은 chemotaxis, 식 균 작용, 항 원 프레 젠 테이 션 및 cytokines 및 반응성 산소 종4,5의 생산에서 포함 된다. 노화 microglia 끊임없이 환경을 조사 하 고4외국 또는 유해한 물질 존재에 의해 활성화 됩니다. 활성화는 CNS 보호4중요 한 프로 염증 반응을 이끌어 낸다. 이 m 1 “프로-염증 성” 형 microglia 주로 항 원 프레 젠 테이 션 및 병원 체4의 죽음에서 포함 된다. Neuroprotection에서 염증 반응의 중요 한 역할에도 불구 하 고 유해 하 고 신경 손상4에 통제 또는 장기간 염증이 될 수 있습니다. 그러나, 특정 환경 자극에 노출 되 면 microglia 염증 형을 전시 수 있습니다. 이러한 프로 M2 microglia 상처 치유 및 복구6, cytokines의 범위를 해제에서 중요 한 역할 그리고 다른 수용 성 중재자 downregulate 염증, 식 균 작용을 증가 하 고 홍보 복구4, 7. microglia의 역할 다양 하 고 다시 myelination8, 뇌졸중 모델9 에 산소와 포도 당 소모 하는 동안 뉴런을 보호 하 고 홍보에 neurite 결과 중 운전 oligodendrocyte 차별화를 포함 척수 부상10모델.
이러한 glial 세포의 연구는 이해 및 조작 neuroinflammation에 대 한 응답에서 중요 한 측면을 나타냅니다. 설명된 프로토콜 microglia 변조 neuroinflammatory 장애에서의 치료 잠재력에 추가 조사에 대 한 수 있습니다.
신경 보호 역할을 향해 microglial 활성화의 변조 조건11,,1213의 범위에 관찰 되었습니다. 따라서, 현재 이해 하 고 더 공부 microglial 활성화의 향상이 중요, 체 외에서 그리고 vivo에서모두를 포함 하 여 다양 한 모델의 사용을 필요로 합니다. 생체 외에서 연구는 그들의 더 큰 효율성, 낮은 비용 및 고립 된 세포 인구 조사 수는 중요 한 도구를 나타냅니다.
다양 한 프로토콜 microglia murine 두뇌에서 효율적으로 좋은 생존 및 고 순도 높은 수익률 샘플 생산에 도전의 격리에 대 한 문헌에 설명 되어 있습니다. 기본 microglia의 절연의 일반적으로 사용 되는 방법 자력 분리와 혼합 glial 문화의 장기간 떨고 있습니다. 개인적인 경험을 통해 자기 열을 저지 한 세포질 파편의 높은 수준의 있었다는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다음 프로토콜 이용 되었다, 어떤 CD11b 자력 분리 뒤 초기 밀도 그라데이션 원심 분리 단계를 통합. 아래에 설명 된 프로토콜은 충분 한 수량에 매우 순수한 샘플 생산 최적화 되었습니다. 그것은 그것의 높은 순도 짧은 기간으로 인해 유리-한 문화 2-3 주에 대 한 필요 없이 2 일 이내에 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜 기본 murine 이다의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia 환경 자극에 의해 변경 둘 다 프로 및 안티-염증, 기능이 있다. 이전 연구 microglia 활성화의 변조 neuroprotection 부여 수 있습니다 나타났습니다. 뉴런을 보호 하 고 부상을 복구 하는 능력은 이러한 복잡 한 세포의 현재 이해를 심화 하기 위해 더 많은 연구를 필요로 합니다. 따라서, 절연 고 순도 기본 microglia의 중요 하 고 유용한 기술입니다. 이것은 높은 순수 기본 microglia 2 일 이내 생체 외…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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