Karakterisering och isolering av mus primära mikroglia täthet lutning centrifugering
Summary
Ett protokoll för isolering av primära mikroglia från murina hjärnor presenteras. Denna teknik hjälper främja aktuell kunskap om neurologiska sjukdomar. Densitet gradient centrifugering och magnetisk separering kombineras för att producera tillräcklig avkastning av ett högt rena urval. Dessutom beskriver vi stegen för karaktärisering av mikroglia.
Abstract
Mikroglia, bosatt immuncellerna i hjärnan, är de första responders till inflammation eller skada i centrala nervsystemet. Nyare forskning har avslöjat mikroglia vara dynamisk, kan förutsatt att både proinflammatoriska och antiinflammatoriska fenotyper. Både M1 (pro-inflammatoriska) och M2 (pro-reparativa) fenotyper spela en viktig roll i neuroinflammatoriska tillstånd som perinatal hjärnskada och uppvisar olika funktioner som svar på vissa stimuli från omgivningen. Moduleringen av mikrogliala aktivering har noterats för att ge neuroprotektion vilket tyder på mikroglia kan ha terapeutiska potential i hjärnskada. Dock mer forskning krävs att bättre förstå rollen av mikroglia i sjukdomen, och detta protokoll underlättar som. Protokollet beskrivs nedan kombinerar en täthet lutning centrifugering process för att minska cellulära skräp, med magnetisk separering, producerar ett högt rena prov av primära mikrogliaceller som kan användas för in vitro experiment, utan den behöver för 2-3 veckor odling. Dessutom ger karakterisering stegen robusta funktionella data om mikroglia, medhjälp studier till bättre förståelse av polariseringen och grundning av dessa celler, som har stark konsekvenser inom regenerativ medicin.
Introduction
Skador som förvärvats under den perinatala perioden från inflammation, hypoxisk-ischemi och blödning kan ha en rad långsiktiga följdtillstånd. Den komplicerade patofysiologin vid perinatal hjärnskada är teoretiserade för att involvera inflammation och ischemi med efterföljande neuronala och axonal död1. Det medfödda immunsvaret spelar en viktig roll i kaskaden av händelser som leder till skada2.
Mikroglia, bosatt immuncellerna inom det centrala nervsystemet (CNS), är de första responders till skada3. Mikroglia är plast celltyper med förmågan att vara både skyddande eller giftiga, beroende på miljön4. De är inblandade i Kemotaxis, fagocytos, antigen-presentation och produktion av cytokiner och reaktivt syre arter4,5. Senescent mikroglia ständigt kartlägga miljön och aktiveras av närvaron av en utländsk eller skadliga ämne4. Aktiveringen leder till en pro-inflammatoriska svar, kritiska i CNS skydd4. Dessa M1 ”pro-inflammatoriska” fenotyp mikroglia är primärt inblandade i antigen-presentation och döden av patogener4. Trots den avgörande rollen i den inflammatoriska reaktionen i neuroprotektion, kan okontrollerad eller långvarig inflammation vara skadlig och leda till nervcellskador4. Men när de utsätts för vissa stimuli från omgivningen, mikroglia kan ställa ut en anti-inflammatorisk fenotyp. Dessa pro-reparativa M2 mikroglia har en avgörande roll i sårläkning och reparera6, släppa en rad cytokiner och andra lösliga medlare att downregulate inflammation, öka fagocytos och främja reparera4, 7. mikroglia roller är varierande och inkluderar drivande oligodendrocyte differentiering under re-myelinisering8, skydda nervceller under syre och glukos utarmning i stroke modeller9 och främja neurite utväxt i ryggmärgsskada modeller10.
Studien av dessa gliaceller representerar en viktig aspekt i att förstå och manipulera neuroinflammation svar. Protokollet beskrivs tillåter för vidare utredning till den terapeutiska potentialen av mikroglia modulering i neuroinflammatoriska sjukdomar.
Moduleringen av mikrogliala aktivering mot en nervskyddande roll har observerats i en rad villkor11,12,13. Således är att förbättra nuvarande förståelse och ytterligare studera modulering av mikrogliala aktivering kritiska, kräver användning av olika modeller inklusive både in vitro och in-vivo. In vitro studier utgör ett viktigt verktyg på grund av deras större effektivitet, lägre kostnad och förmåga att utreda en isolerad cell befolkning.
I området i närheten finns det en rad protokoll som beskrivs i litteraturen för isolering av mikroglia från murina hjärnor, utmaningen att effektivt producera en hög kapacitet prov med god lönsamhet och hög renhet. Vanliga metoder för isolering av primära mikroglia är av magnetisk separering och långvarig skakar av blandade gliaceller kulturer. Genom personlig erfarenhet konstaterades att det fanns en hög grad av cellulära skräp som blockerat den magnetiska kolumnen. Således utnyttjades följande protokoll, vilken inlemmar en inledande täthet lutning centrifugeringssteget följt av CD11b magnetisk separering. Protokollet beskrivs nedan har optimerats för att producera ett högt rena prov i tillräcklig mängd. Det är en fördel på grund av dess hög renhet och kort tidsperiod — man kan utföra analyser inom 2 dagar utan att behöva kultur för 2-3 veckor. Detta protokoll kan potentiellt anpassas för isolering av primära murina astrocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia har förmågan att vara både pro- och antiinflammatoriska, ändras genom miljön stimuli. Tidigare studier har visat moduleringen av mikroglia aktivering kan ge neuroprotektion. Deras förmåga att ge skydd till nervceller och reparera skadan kräver mer forskning för att ytterligare aktuell kunskap om dessa komplexa celler. Isolering av hög renhet primära mikroglia är alltså en viktig och användbar teknik. Detta är en relativt snabb metod att få högt rena primära mikroglia redo för in vitro-</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
