JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

Abstract

שילוב גנטי של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) דרך ענבר stop codon דיכוי היא טכניקה חזקה להתקין מלאכותי כשמכשיר ורובוט moieties תגובתי על גבי חלבונים ישירות בתא בשידור חי. כל המכללות מעוגנת מאת ייעודי אורתוגונלית משתיק קול-tRNA/אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) זוג זה מיובא לתוך האורגניזם המארח. היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול מאוד שונים זה מזה, משביע רצון במקרים מסוימים. זוגות אורתוגונלית יכולים להשתפר על ידי מניפולציה של AARS או של tRNA. עם זאת, אבולוציה מכוונת של tRNA או AARS באמצעות ספריות גדולות ושיטות בחירה המלח/חיה אינם ריאלי בתאי יונקים. כאן, מוצג נתיישב וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית בתאי יונקים. הבדיקה מאפשרת הקרנת עשרות למאות גרסאות AARS/tRNA עם מאמץ מתון, בתוך זמן סביר. שימוש assay הזה כדי ליצור tRNAs חדשים המשפרים באופן משמעותי את היעילות של מערכת אורתוגונלית פירוליזין מתואר, יחד עם היישום של ncAAs במחקר של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), אשר הם מאתגרים אובייקטים עבור ליגת המכללות מוטגנזה מכוונת. ראשית, משלבים באופן שיטתי של ncAA צילום-crosslinking לאורך כל השטח חוץ-תאי של קולטן, אתרי קישור של ליגנדים שונים על הקולטן שלם ממופות ישירות בתא בשידור חי. השני, על ידי שילוב מהדור האחרון ncAAs GPCR, קולטן ללא זרז מרביים תיוג עם תיוג הפלורסנט הוכח, אשר מנצלת את bioorthogonal זן-קידום הפוך תגובת דילס אלדר cycloaddition (SPIEDAC) על התא בשידור חי. כפי ncAAs ניתן להחיל באופן כללי על כל חלבון באופן עצמאי על גודלו, השיטה היא עניין כללי עבור מספר יישומים. בנוסף, התאגדות המכללות אינו דורש שום ציוד מיוחד, מתבצע בקלות במעבדות לביוכימיה סטנדרטי.

Introduction

שילוב גנטי של הגששים כימי לחלבונים היא שיטה חזקה כדי להקל על החקירה של היבטים מבניים ודינאמי של פונקציה של חלבונים ישירות בהקשר מקורית של תא חי. כיום, מאות חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) מצוידים עם הקבוצות כימיים שונים ביותר שניתן site-specifically לשלב חלבונים על ידי ביוסינטזה1,2,3,4. ביניהם, אחד מוצא צילום רגיש ncAAs כגון צילום-crosslinkers5, בכלוב צילום6,–7,–8,–9 חומצות אמינו צילום-להחלפה10, 11, חומצות אמיניות הנושאים מאומצות alkenes ו alkynes bioorthogonal ללא זרז כימיה2,12,13,14,15,16 ,17חומצות אמינו נושאת dansyl18קומרין9,19, fluorophores21 prodan20,, חומצות אמינו מצויד הגששים biophysical אחרים כמו . טוב כמו עם פוסט שינויים translational1,2,3,4,22,23,24,25.

קידוד גנטי של ליגת המכללות מופעלת כברירת ייעודי אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר (AARS) לקשר של cognate משתיק קול-tRNA, אשר משלבת ncAA בתגובה ענבר stop codon במהלך הסינתזה ribosomal רגיל. ncAARS/tRNA זוגות מתוכננים כדי להיות אנכיים בתוך האורגניזם המארח, קרי לא צולבות לדבר עם זוגות אנדוגני. הטכניקה היא מבוססת היטב הן prokaryotic ו האיקריוטים המארחים והן בקלות החלים בתרבית של תאים. זוגות של התאגדות המכללות בתאים בתרבית של מבוססים על שלוש השיטות העיקריות אורתוגונלית: מערכת tyrosyl, המשלב את TyrRS של e. coli26 עם משתיקול ענבר tyrosyl מ- stearothermophilus נולד ב-27 (Ec TyrRS / זוג יםבסט), e. coli leucyl מערכת (EcLeuRS/tRNALeuצ’ואה צמד)6,18,28 ומערכת pyrrolysyl archaeal (PylRS/tRNA Pyl זוג)3, לפיה tRNAPyl זה משתיקול ענבר טבעי. באופן כללי, בכל המכללות מזוהה על-ידי ncAARS מיוחדים. בהתאם למבנה של ncAA, ncAARS, מתקבל באמצעות אבולוציה מכוונת של TyrRS, LeuRS או PylRS, למרות כמה synthetases יכול לקבל ncAA אחד או יותר.

הזוג אורתוגונלית מיובא לתוך התאים על ידי שימוש פשוט וקטור פלסמיד. פלסמידים נפוץ ויעיל ביותר bicistronic, לקודד גם את המעביר וגם את סינתזת ויוצרים זוג אורתוגונלית29. השני פלסמיד קידוד החלבון עניין הנושאת codon ענבר באתר המיועד השינוי הוא transfected משותפת. מדיום הגידול תא פשוט נוסף ncAA. עם זאת, קבוצות מיוחדות שונות מרבים להשתמש וריאציות שונות של פלסמיד בונה גם עבור שילוב של ncAA באותה. מבנים שונים בהסדר של הגנים וקטור, סוג המעביר, השימוש codon המעביר גנים, יזם שימוש, וריאנט של tRNA, מספר קלטות ביטוי tRNA. יתר על כן, היעילות התאגדות של ncAAs שונים יכול להשתנות באופן דרסטי עקב יעילות קטליטי שונים synthetases שונים, על האיכות של tRNA, ועל אחרים גורמים30. לכן חשוב שתהיה בהישג יד שיטה מהירה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוג אורתוגונלית, לבחור את המערכת המתאימה ביותר עבור יישום הרצויה וגם לבצע כמה פעולות אופטימיזציה לשיפור שהביטוי חלבון התשואות.

הקמנו פשוט וחזק מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית29 (איור 1). ב וזמינותו, התאים הם שיתוף transfected עם פלסמיד קידוד בשביל זוג אורתוגונלית, יחד עם פלסמיד כתב bicistronic קידוד הן חלבון פלואורסצנטי ירוק הנושאת של ענבר stop codon במיקום מתירניות (EGFPתג) ו ג’ין mCherry. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק של כל תא lysates נקראים בערוצים נפרדים על קורא צלחת, צלחת 96-ובכן. עוצמת קרינה פלואורסצנטית ירוק להרכב ישירות היעילות של דיכוי ענבר, ואילו עוצמת פלואורסצנטי אדום נותן הערכה ישירה של גודל המדגם נמדד ואת היעילות תרביות תאים. לגבי מבחני דומה המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית תא בסיוע מיון (FACS) לקרוא את31,32, וזמינותו נותן הערכה מיידית ומקיפה של ביטוי חלבון באוכלוסייה התא כולו, אשר יותר הנציגה של תנאי הניסוי הרגיל, ומציע של רכישת נתונים ועיבוד קל יותר עם תוכנה רגילה. בסך הכל, היתרון העיקרי של וזמינותו היא כי ניתן לנתח בינוני למספר רב של דגימות במקביל. שימוש assay הזה, המופרות, ספריה מעוצבת בצורה רציונלית של משתיק קול-tRNAs כדי לשפר את היעילות של מערכת אורתוגונלית Pyl30. עבודה זו מתארת את נסיוני לבצע assay הזה ולהראות דוגמאות של היישום שלה, כולל אופטימיזציה של הזוג אורתוגונלית כהכנה לסיפוח צילום-crosslinking ncAA p-azido-L-פנילאלנין (עזי), השוואת התאגדות היעילות של חומצות אמינו שונות (איור 2).

במהלך השנים האחרונות, כלים ncAA הוכחו רבת עוצמה כדי לחקור מבנה ועל היבטים הפונקציונלית של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. בבני אדם, GPCRs יוצרים משפחה גדולה של קולטני ממברנה (800 חברים) והם מייצגים למטרות טיפוליות סמים. אפיון מבניים ישירה של GPCRs עדיין מאתגר, שיטות ביוכימיות משלימים יש צורך מאוד החקירה שלהם. אנחנו צריכים חלוץ השימוש ncAAs צילום-crosslinking למפות GPCR משטחים ולגלות ליגנד איגוד כיסים34. משתמש שלנו מערכת אופטימיזציה עבור עזי התאגדות, אנחנו באופן שיטתי שולבו עזי לאורך כל juxtamembrane בתחום GPCR ישירות בתאים בתרבית של חיה. בעת הקרנת UV, עזי טפסים זן nitrene תגובתי הלוכד covalently מולקולות שכנות. כאשר המערכת נוספת של ליגנד, עזי משמשת בדיקה קרבה לחשוף אילו עמדות של הקולטן להתקרב ליגנד מאוגד. בדרך זו, מצב איגוד של ההורמון neuropeptide Urocortin (Ucn1) על הקולטן class B GPCR corticotropin שחרור-פקטור שהקלדתי (CRF1R) 133 היה הראשון שנחשף. לאחרונה, חשפנו איגוד ברורים דפוסים של אגוניסטים של היריבים על קולטן זהה38. בגישה דומה הוחל על ידי אחרים כדי לחשוף את orthosteric ואת אתרי קישור allosteric של אחרים פפטידים, מולקולה קטנה ליגנדים על אחרים GPCRs39,40,41,42. כתב יד זה מתאר את נסיוני חלה במעבדה שלנו עבור צילום-crosslinking מיפוי של משטחים GPCR. השיטה היא יחסית מהירה, פשוטה, אינו דורש שום ציוד מיוחד, כך הוא ישים במעבדות לביוכימיה סטנדרטי. חשוב מכך, הגישה מספק כלי חשוב לא רק כדי לזהות אתרי קישור ליגנד שבו נתונים תלת-ממדיים מבניים נדירים, אלא גם כדי להשלים במבחנה נתונים קיימים עם מידע של רצפטורים שונה לחלוטין post-translationally סביבת פיזיולוגיים של תא חי.

ההתפתחות האחרונה של הרומן ncAAs הנושאת על שרשרת צד מתאים כימיה מרביים bioorthogonal ללא זרז כימי הקבוצות נפתחה האפשרות להתקין fluorophores מהדור האחרון עבור הדמיה ברזולוציה סופר לחלבונים ישירות על חיים תאים2,43. עוגנים כימיים לכלול מאומצות cyclooctyne SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17, טרנס-cyclooctenes ב TCO * K13,15,17 בין ncAAs אחרים מחסה של norbornene16,17,44 או cyclopropene45,46 moiety. NcAAs מגושם bioorthogonal כימיה משולבים על-ידי גרסה של PylRS בדרך כלל מסומן בתור PylRSAF (המציין מוטציה Y271A ו- Y349F ב barkeri מ PylRS), וכן על ידי אחרים ncAARSs אד הוק התפתחו17 , 44. עוגנים bioorthogonal להגיב עם ריאגנטים tetrazine47 באמצעות דרישה אלקטרון הופכי cycloaddition תגובת דילס-אלדר לתת תפוקה גבוהה תיוג בתוך כמה דקות43,48. עם זאת, יישום של גישה זו עוצמה לתווית GPCRs מאתגרת עקב היעילות הכוללת נמוכה של מערכת אורתוגונלית התאגדות המכללות. באמצעות המערכת שלנו Pyl משופר, לאחרונה הראו התאגדות לתפוקה גבוהה של חומצות אמינו כזה לתוך GPCRs GPCR מרביים תיוג על פני השטח של תאים בתרבית של חיים30. קולטנים שכותרתו היו עדיין מתפקד, כפי שהם הפנימו פיזיולוגית בעת הפעלת הקולטן עם אגוניסט. פרוטוקול ניסיוני עבור שילוב של bioorthogonal עוגנים לתוך GPCRs, תיוג בשלבים הבאים מתוארים כאן. מצייד GPCRs עם fluorophores בהיר קטן הוא היסוד צעד לקראת לימוד GPCR dynamics מבניים בתא בשידור חי באמצעות טכניקות מתקדמות במיקרוסקופ.

Protocol

1. קרינה פלואורסצנטית המבוסס על הקרנת הסרט התאגדות יעילות (איור 1) לשמור על תאים HEK293 במדיום ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM; גלוקוז גבוהות, גלוטמין 4 מ מ, פירובט) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו- 5% CO2. הזרע התאים ?…

Representative Results

קווי המתאר של קרינה פלואורסצנטית וזמינותו מתואר באיור1. שלושה יישומים מועסק וזמינותו. במקום הראשון, מוקרנים מספר גרסאות tRNA על התאגדות של Lys(Boc) על ידי הזוג אורתוגונלית Pyl. Lys(Boc) היא חומצת אמינו דומה sterically Pyl. כפי Pyl אינו זמין מסחרית, Lys(Boc) משמש בדרך – כלל מצע סט?…

Discussion

הפרוטוקול מתאר של assay פשוטה ואמינה כדי להעריך את היעילות של זוגות אורתוגונלית כהכנה לסיפוח ncAAs לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בכל הנוגע בשימוש נרחב מבחני בהתבסס על FACS הוא שזה מאפשר מדידה של מספר גדול של דוגמאות והכנה בו זמנית, מספק נתונים בקלות מאבחנים באמצעות תוכנה ר?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו הוקם על ידי דויטשה פתוח (DFG) תחת מענקים CO822/2-1 (אמי נתר תוכנית) ו- CO822/3-1 כדי אי. סי

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochimie. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chimie. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/fr/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image