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Chimie

फोटो के लिए GPCRs में रासायनिक जांच के आनुवंशिक निगमन-crosslinking मानचित्रण और लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में Bioorthogonal रसायन विज्ञान का अनुकूलन

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

एक सतही प्रतिदीप्ति परख अमीनो की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है-acyl-tRNA-synthetase/tRNA जोड़े शामिल गैर विहित अमीनो-एसिड (ncaas) प्रोटीन में स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की । जी का अध्ययन करने के लिए ncaas के आवेदन प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) फोटो crosslinking बाइंडिंग साइटों की मानचित्रण और bioorthogonal GPCR रहते कोशिकाओं पर लेबलिंग सहित वर्णित है ।

Abstract

गैर के आनुवंशिक शामिल-विहित अमीनो एसिड (ncaas) एंबर रोक codon दमन के माध्यम से एक शक्तिशाली तकनीक को सीधे जीवित कोशिका में प्रोटीन पर कृत्रिम जांच और प्रतिक्रियाशील moieties स्थापित है । प्रत्येक ncAA एक समर्पित ओर्थोगोनल दमन-tRNA/एमिनो-acyl-tRNA-synthetase (AARS) जोड़ी है कि मेजबान जीव में आयात किया जाता है द्वारा शामिल है । विभिंन ncaas के निगमन दक्षता बहुत अलग कर सकते हैं, और कुछ मामलों में असंतोषजनक है । ओर्थोगोनल जोड़े या तो AARS या tRNA जोड़ तोड़ से सुधार किया जा सकता है । हालांकि, tRNA या बड़े पुस्तकालयों और मृत/जिंदा चयन विधियों का उपयोग AARS के विकास का निर्देश स्तनधारी कोशिकाओं में व्यवहार्य नहीं हैं । इधर, स्तनधारी कोशिकाओं में ओर्थोगोनल जोड़े की कुशलता का मूल्यांकन करने के लिए एक सतही और दमदार प्रतिदीप्ति आधारित परख प्रस्तुत की गई है. परख एक उदारवादी प्रयास के साथ AARS/tRNA वेरिएंट के सैकड़ों को दसियों स्क्रीनिंग की अनुमति देता है और एक उचित समय के भीतर । इस परख का उपयोग करने के लिए नए tRNAs कि काफी pyrrolysine ओर्थोगोनल प्रणाली की क्षमता में सुधार उत्पंन करने के साथ वर्णित है, जी के अध्ययन के लिए ncaas के आवेदन के साथ प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs), जो ncaa के लिए वस्तुओं को चुनौती दे रहे हैं mutagenesis । पहले, व्यवस्थित एक रिसेप्टर के extracellular सतह भर में एक तस्वीर crosslinking ncAA शामिल करके, बरकरार रिसेप्टर पर अलग लाइगैंडों के बंधन साइटों सीधे लाइव सेल में मैप कर रहे हैं. दूसरा, एक GPCR, ultrafast उत्प्रेरक-मुक्त रिसेप्टर एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग में अंतिम पीढ़ी के ncaa को शामिल करके प्रदर्शन किया है, जो bioorthogonal तनाव-पदोंनत व्युत्क्रम Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) जी सेल पर बढ़ावा दिया । के रूप में ncaas आम तौर पर किसी भी प्रोटीन के लिए स्वतंत्र रूप से अपने आकार पर लागू किया जा सकता है, विधि आवेदनों की एक संख्या के लिए सामांय ब्याज की है । इसके अलावा, ncAA निगमन किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और आसानी से मानक जैव रसायन प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया ।

Introduction

प्रोटीन में रासायनिक जांच के आनुवंशिक निगमन एक शक्तिशाली विधि सीधे जीवित कोशिका के मूल संदर्भ में प्रोटीन समारोह के संरचनात्मक और गतिशील पहलुओं की जांच की सुविधा है । आजकल, गैर-विहित अमीनो एसिड के सैकड़ों (ncaas) सबसे अलग रासायनिक समूहों के साथ सुसज्जित साइट-विशेष रूप से जैव संश्लेषण1,2,3,4द्वारा प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है । उन दोनों के बीच, एक फोटो के रूप में संवेदनशील ncaas ढूंढता है-crosslinkers5, फोटो-पिंजरा6,7,8,9 और फोटो स्विच अमीनो एसिड10, 11, अमीनो एसिड उत्प्रेरक मुक्त bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए तनावपूर्ण alkenes और alkynes असर2,12,13,14,15,16 ,17, एमिनो एसिड dansyl ले जाने18, अनंतमूलि9,19, और prodan20,21 fluorophores, और एमिनो एसिड अन्य के रूप में भौतिक जांच से सुसज्जित अच्छी तरह के रूप में पोस्ट शोधों संशोधनों के साथ1,2,3,4,22,23,24,25.

एक ncaa के आनुवंशिक एंकोडिंग एक समर्पित अमीनो द्वारा सक्षम है-acyl-tRNA-synthetase (AARS) एक cognate शमन करने के लिए युग्मित-tRNA, जो नियमित codon संश्लेषण के दौरान एक एंबर रोक राइबोसोमल के जवाब में ncAA शामिल हैं । ncAARS/tRNA जोड़े इंजीनियर होते हैं ताकि मेजबान जीव में ओर्थोगोनल हो, यानी अंतर्जात जोड़े के साथ क्रॉस-टॉक न हो. तकनीक अच्छी तरह से दोनों prokaryotic और eukaryotic मेजबान में स्थापित है और आसानी से स्तनधारी कोशिकाओं को लागू । स्तनधारी कोशिकाओं में ncAA शामिल करने के लिए जोड़े तीन मुख्य ओर्थोगोनल प्रणालियों पर आधारित हैं: tyrosyl प्रणाली है, कि ई. कोलाई26 से TyrRS एक tyrosyl एंबर दमन के साथ बी stearothermophilus27 से जोड़ती है (चुनाव आयोग TyrRS/Bstयम् जोड़ी), ई. कोलाई leucyl प्रणाली (ईसीLeuRS/tRNAलियूकूए pair)6,18,28 और archaeal pyrrolysyl सिस्टम (PylRS/tRNA Pyl जोड़ी)3, जिससे tRNAPyl एक प्राकृतिक एंबर दमन है । सामांय में, प्रत्येक ncAA एक विशेष ncAARS द्वारा मांयता प्राप्त है । ncaa की संरचना पर निर्भर करता है, ncAARS या तो TyrRS, LeuRS या PylRS का निर्देशन विकास के द्वारा प्राप्त की है, हालांकि कुछ synthetases एक से अधिक ncAA स्वीकार कर सकते हैं ।

ओर्थोगोनल जोड़ी केवल एक प्लाज्मिड वेक्टर का उपयोग करके कोशिकाओं में आयात किया जाता है । सबसे आम और कुशल plasmids bicistronic और synthetase और ओर्थोगोनल जोड़ी के गठन tRNA के लिए दोनों सांकेतिक शब्दों में बदलना कर रहे है29। एक दूसरा प्लाज्मिड संशोधन के लिए नामित साइट पर एक एंबर codon असर ब्याज के प्रोटीन के लिए एंकोडिंग सह है transfected । ncAA बस सेल विकास माध्यम में जोड़ा गया है । हालांकि, विभिंन विशिष्ट समूहों अक्सर प्लाज्मिड के विभिंन वेरिएंट का उपयोग भी एक ही ncAA के शामिल करने के लिए निर्माण । निर्माण वेक्टर में जीन की व्यवस्था में अलग, synthetase के प्रकार, synthetase जीन में codon उपयोग, प्रवर्तक उपयोग, tRNA के संस्करण और tRNA अभिव्यक्ति कैसेट की संख्या । । इसके अलावा, विभिंन ncaas के निगमन दक्षता काफी अलग synthetases के विभिंन उत्प्रेरक दक्षता, tRNA की गुणवत्ता, और अंय कारकों के कारण भिंन हो सकते है30। इसलिए, यह एक ओर्थोगोनल जोड़ी की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए हाथ में एक तेज और विश्वसनीय विधि है, दोनों एक वांछित आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त प्रणाली का चयन करने के लिए और कुछ अनुकूलन कदम है कि समग्र प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है पैदावार.

हम एक सरल और मजबूत प्रतिदीप्ति आधारित परख की स्थापना की है ओर्थोगोनल जोड़े29 (चित्रा 1) की दक्षता का मूल्यांकन । परख में, कोशिकाओं को सह रहे है ओर्थोगोनल जोड़ी के लिए प्लाज्मिड एंकोडिंग के साथ transfected, एक bicistronic रिपोर्टर प्लाज्मिड हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दोनों एंकोडिंग एक codon स्थिति में एक एंबर बंद स्वतंत्र असर (EGFPटैगके साथ) और mCherry जीन. साबुत-सेल lysates के लाल और हरे प्रतिदीप्ति एक प्लेट रीडर पर 96-वेल प्लेट में अलग चैनल में पढ़ते हैं । हरे प्रतिदीप्ति की तीव्रता एंबर दमन की दक्षता के साथ सीधे संबद्ध है, जबकि लाल प्रतिदीप्ति की तीव्रता मापा नमूना और अभिकर्मक दक्षता के आकार का एक सीधा अनुमान देता है । इसी तरह प्रतिदीप्ति असिस्टेड सेल छँटाई (FACS) के आधार पर समान परख के संबंध में बाहर पढ़ें31,32, परख पूरे सेल जनसंख्या में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक तत्काल और व्यापक आकलन देता है, जो अधिक है सामांय प्रयोगात्मक शर्तों के प्रतिनिधि, और मानक सॉफ्टवेयर के साथ एक आसान डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रदान करता है । कुल मिलाकर, परख का मुख्य लाभ यह है कि नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए एक माध्यम समानांतर में विश्लेषण किया जा सकता है । इस परख का प्रयोग, हम दमन-tRNAs के एक तर्कसंगत डिजाइन पुस्तकालय की जांच की है Pyl ओर्थोगोनल प्रणाली की क्षमता में सुधार30। इस काम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए इस परख प्रदर्शन और अपने आवेदन के उदाहरण दिखाने के लिए, फोटो के शामिल करने के लिए ओर्थोगोनल जोड़ी के अनुकूलन सहित-crosslinking ncAA p-azido-L-फेनिलएलनिन (Azi) और की तुलना विभिंन अमीनो एसिड (चित्रा 2) की क्षमता को शामिल करना ।

पिछले वर्षों में, ncAA उपकरण बहुत जी के संरचनात्मक और कार्यात्मक पहलुओं की जांच करने के लिए शक्तिशाली साबित किया गया है प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. मनुष्यों में, GPCRs झिल्ली रिसेप्टर्स (800 सदस्यों) के एक बड़े परिवार के रूप में और चिकित्सीय दवाओं के लिए मुख्य लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । GPCRs के प्रत्यक्ष संरचनात्मक लक्षण वर्णन अभी भी चुनौतीपूर्ण है और जैव रासायनिक तरीकों पूरक अत्यधिक उनकी जांच के लिए आवश्यक हैं । हम GPCR सतहों नक्शा और ligand बंधन जेब34की खोज करने के लिए फोटो crosslinking ncaas के उपयोग का बीड़ा उठाया है । Azi निगमन के लिए हमारे अनुकूलित प्रणाली का उपयोग करना, हम व्यवस्थित सीधे एक GPCR के पूरे juxtamembrane डोमेन में Azi शामिल रहते स्तनधारी कोशिकाओं में । यूवी विकिरण पर, Azi एक उच्च प्रतिक्रियाशील nitrene प्रजातियों कि covalently पड़ोसी अणुओं कब्जा रूपों । जब ligand प्रणाली में जोड़ा जाता है, Azi एक निकटता जांच के रूप में कार्य करता है पता चलता है जो रिसेप्टर की स्थिति बंधे ligand के करीब आते हैं । इस तरह, वर्ग बी GPCR corticotropin पर neuropeptide हार्मोन Urocortin मैं (Ucn1) के बंधन मोड-रिलीज कारक रिसेप्टर प्रकार 1 (CRF1R)33 पहले का अनावरण किया गया था । हाल ही में, हम एक ही रिसेप्टर38पर एगोनिस्ट और विरोधी के अलग बाध्यकारी पैटर्न का खुलासा किया है । एक समान दृष्टिकोण अंय पेप्टाइड्स और छोटे अणु लाइगैंडों के अंय GPCRs39,40,41,42पर orthosteric और allosteric बाध्यकारी साइटों को प्रकट करने के लिए दूसरों के द्वारा लागू किया गया है । इस पांडुलिपि का वर्णन प्रयोगात्मक GPCR सतहों के फोटो crosslinking मानचित्रण के लिए हमारी प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल । विधि अपेक्षाकृत तेज है, सीधा है और किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, इसलिए है कि यह मानक जैव रसायन प्रयोगशालाओं में लागू है । महत्वपूर्ण बात, दृष्टिकोण न केवल ligand बाध्यकारी साइटों जहां 3 डी संरचनात्मक डेटा दुर्लभ है की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है, लेकिन यह भी पूरी तरह से पोस्ट-अनुवाद में संशोधित रिसेप्टर्स से जानकारी के साथ इन विट्रो डेटा में मौजूदा पूरक करने के लिए लाइव सेल के शारीरिक वातावरण ।

उपंयास ncaas साइड चेन रासायनिक समूहों ultrafast उत्प्रेरक मुक्त bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए उपयुक्त पर असर के हाल के विकास के लिए खोला गया है संभावना प्रोटीन में सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए पिछले पीढ़ी fluorophores स्थापित करने के लिए सीधे जीवित कोशिकाओं2,43पर । इस तरह के रासायनिक एंकरों में SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne में BCNK12,17, और ट्रांस-cyclooctenes में TCO * K13,15,17 अन्य ncaas के बीच तनावपूर्ण cyclooctyne शामिल हैं हार्बर एक norbornene१६,१७,४४ या cyclopropene४५,४६ moiety. bioorthogonal रसायन विज्ञान के लिए महाकाय ncaas PylRS के एक संस्करण द्वारा आम तौर पर PylRSवायुसेना के रूप में चिह्नित (उत्परिवर्तन Y271A और Y349F में एम. barkeri PylRS), के रूप में के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय तदर्थ विकसित ncAARSs17 द्वारा शामिल कर रहे है , 44. bioorthogonal लंगर tetrazine रिएजेंट47 के साथ उलटा इलेक्ट्रॉन के माध्यम से प्रतिक्रिया-मांग Diels-Alder cycloaddition कुछ मिनट43,48के भीतर उच्च लेबलिंग पैदावार दे । हालांकि, इस शक्तिशाली दृष्टिकोण के आवेदन GPCRs लेबल करने के लिए ओर्थोगोनल ncAA शामिल प्रणाली की एक कम समग्र दक्षता के कारण चुनौतीपूर्ण है । हमारे बढ़ाया Pyl प्रणाली का उपयोग करना, हम हाल ही में प्रदर्शन किया है उच्च GPCRs और ultrafast में ऐसे अमीनो एसिड की उपज शामिल GPCR लाइव स्तनधारी कोशिकाओं की सतह पर लेबलिंग30। लेबल रिसेप्टर्स अभी भी कार्यात्मक थे, के रूप में वे शारीरिक रूप से एक एगोनिस्ट के साथ रिसेप्टर को सक्रिय करने पर आंतरिक. GPCRs में bioorthogonal लंगरों के शामिल होने के लिए प्रायोगिक प्रोटोकॉल और निंनलिखित लेबलिंग कदम यहां वर्णित हैं । लैस GPCRs छोटे उज्ज्वल fluorophores के साथ उन्नत माइक्रोस्कोपी तकनीक के माध्यम से लाइव सेल में GPCR संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन की ओर पहला मौलिक कदम है.

Protocol

1. प्रतिदीप्ति-निगमन क्षमता के आधार पर स्क्रीनिंग (चित्रा 1) Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में HEK293 कोशिकाओं को बनाए रखने (DMEM; उच्च ग्लूकोज, 4 मिमी glutamine, पाइरूवेट) 10% के साथ पूरक (वी/वी) भ्रूण गोजातीय ?…

Representative Results

प्रतिदीप्ति परख की रूपरेखा चित्रा 1में दिखाया गया है । परख तीन आवेदनों में कार्यरत है । फर्स्ट प्लेस में Pyl ओर्थोगोनल पेयर द्वारा Lys (बीओसी) के लिए tRNA वेरिएंट की संख्या दिखलाई जाती ?…

Discussion

प्रोटोकॉल का वर्णन एक सरल और विश्वसनीय परख के लिए ncaas के शामिल करने के लिए ओर्थोगोनल जोड़े की दक्षता का आकलन प्रोटीन में स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त की । FACS के आधार पर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख के ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) द्वारा अनुदान CO822 के तहत स्थापित किया गया है/2-1 (एमी-Noether कार्यक्रम) और CO822/3-1 से आईसी

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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References

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Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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