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Chimie

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Un’analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l’efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L’applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Abstract

La genetica incorporazione di aminoacidi non canonico (ncAAs) via soppressione di codone di arresto ambra è una tecnica potente per installare sonde spaziali e reattiva moiety su proteine direttamente nella cella dal vivo. Ogni ncAA è incorporato da una dedicato coppia ortogonale soppressore-/ amino-acil-tRNA-sintetasi del tRNA (AARS) che viene importata nell’organismo ospite. L’efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa notevolmente differiscono ed essere insoddisfacente in alcuni casi. Coppie ortogonali possono essere migliorate modificando le RAA o il tRNA. Tuttavia, la diretta evoluzione del tRNA o AARS utilizzando librerie di grandi dimensioni e metodi di selezione morti/vivi non sono fattibili in cellule di mammifero. Qui, è presentata un’analisi di fluorescenza-basata facile e robusta per valutare l’efficienza di coppie ortogonali in cellule di mammifero. Il dosaggio permette lo screening di decine o centinaia di varianti AARS/tRNA con uno sforzo moderato ed entro un termine ragionevole. Uso di questo test per generare nuove tRNAs che migliorano significativamente l’efficienza del sistema ortogonale Pirrolisina è descritto, insieme all’applicazione di ncAAs allo studio di proteine G accoppiate recettori (GPCR), che rappresentano una sfida oggetti per ncAA mutagenesi. In primo luogo, incorporando sistematicamente un foto-reticolazione ncAA su tutta la superficie extracellulare di un recettore, siti di legame di diversi ligandi del recettore intatto vengono mappati direttamente nella cella dal vivo. Secondo, incorporando ncAAs di ultima generazione in un GPCR, recettore privo di catalizzatore ultraveloce etichettatura con un colorante fluorescente è dimostrato, che sfrutta bioorthogonal ceppo-promosso inversa Diels Alder cicloaddizione (SPIEDAC) su cellule vive. Come ncAAs può essere generalmente applicato a qualsiasi proteina indipendentemente dalla sua dimensione, il metodo è di interesse generale per un numero di applicazioni. Inoltre, incorporazione di ncAA non richiede particolari attrezzature e viene facilmente eseguita nei laboratori di biochimica standard.

Introduction

L’incorporazione di genetica di sonde chimiche in proteine è un metodo potente per lo studio degli aspetti strutturali e dinamici di funzione della proteina direttamente nel contesto nativo della cella dal vivo. Al giorno d’oggi, centinaia di aminoacidi non canonico (ncAAs) equipaggiati con i più disparati gruppi chimici possa essere site-specifically incorporato nelle proteine di biosintesi1,2,3,4. Tra loro, si trova ncAAs fotosensibili come foto-reticolanti5, foto-messo in gabbia6,7,8,9 e foto-commutabile aminoacidi10, 11, aminoacidi cuscinetto sforzata alcheni o alchini per bioorthogonal privo di catalizzatore chimica2,12,13,14,15,16 ,17, aminoacidi che trasportano dansile18, cumarina9,19e fluorofori21 prodan20,e aminoacidi con altre sonde biofisiche come nonché con post traduzionale modifiche1,2,3,4,22,23,24,25.

La codifica genetica di un ncAA è attivata da una dedicato amino-acil-tRNA-sintetasi (AARS) abbinata ad un soppressore cognato-tRNA, che incorpora la ncAA in risposta ad un codone di arresto ambra durante la normale sintesi ribosomiale. coppie di ncAARS/tRNA sono progettate in modo da essere ortogonali nell’organismo ospitante, cioè non cross-talk con le coppie endogene. La tecnica è affermata sia in procarioti ed eucarioti padroni di casa e cellule facilmente applicabile ai mammiferi. Coppie per l’incorporazione di ncAA in cellule di mammifero si basano su tre principali sistemi ortogonali: il sistema di tyrosyl, che combina il TyrRS da e. coli26 con un soppressore di tyrosyl ambra da b. stearothermophilus27 (CE TyrRS / coppia YamBst), l’e. coli leucyl sistema (CELeuRS/tRNALeuCUA coppia)6,18,28 e il sistema di pyrrolysyl degli Archaea (PylRS/tRNA PYL coppia)3, per cui il tRNAPyl è un soppressore di ambra naturale. In generale, ogni ncAA è riconosciuto da un ncAARS specializzato. A seconda della struttura della ncAA, la ncAARS è ottenuta tramite diretta evoluzione di TyrRS, LeuRS o PylRS, anche se alcune sintetasi possono accettare più di un ncAA.

La coppia ortogonale viene importata nelle celle utilizzando semplicemente un vettore plasmidico. Plasmidi più comune ed efficiente sono sialophosphoprotein e codificano sia per la sintetasi e il tRNA che formano la coppia ortogonale29. Un secondo plasmide che codifica per la proteina di interesse tenendo un codone ambrato presso il sito designato per la modifica è co-trasfettata. La ncAA è semplicemente aggiunta al medium della crescita cellulare. Tuttavia, diversi gruppi specializzati usano spesso diverse varianti del plasmide costrutti anche per l’incorporazione della stessa ncAA. Costrutti differiscono nella disposizione dei geni in vettoriale, tipo della sintetasi, l’utilizzo di codone nel gene sintetasi, l’utilizzo del promotore, variante del tRNA e il numero di cassette di espressione di tRNA. Inoltre, l’efficienza di incorporazione di ncAAs differenti possa variare drasticamente a causa la diversa efficienza catalitica della sintetasi diversi, la qualità del tRNA e altri fattori30. Pertanto, è importante avere a portata di mano un metodo veloce e affidabile per valutare l’efficienza di una coppia ortogonale, di scegliere il sistema più adatto per un’applicazione desiderata sia per eseguire alcune operazioni di ottimizzazione che migliorare la complessiva espressione della proteina rendimenti.

Abbiamo stabilito un’analisi semplice e robusta fluorescenza-basata per valutare l’efficienza di coppie ortogonali29 (Figura 1). Nell’analisi, le cellule vengono co-trasfettate con il plasmide che codifica per la coppia ortogonale, insieme con un plasmide del reporter sialophosphoprotein codifica per la proteina fluorescente verde recante un codone di stop ambra in una posizione permissiva (EGFPTAG) e il mCherry gene. Fluorescenza rossa e verde di lisati di cellule intere vengono lette in canali separati su un lettore di piastra in una piastra a 96 pozzetti. L’intensità della fluorescenza verde direttamente correla con l’efficienza di ambra soppressione, considerando che l’intensità di fluorescenza rossa dà una stima diretta delle dimensioni del campione misurato e l’efficienza di trasfezione. Rispetto a simili saggi basati sulla fluorescenza assistita cella ordinamento (FACS) leggere31,32, il test fornisce una valutazione immediata e approfondita dell’espressione della proteina nella popolazione intera cellula, che è più rappresentativo delle usuali condizioni sperimentali e offre una più facile acquisizione ed elaborazione dati con software standard. Nel complesso, il vantaggio principale dell’analisi è che un mezzo per un gran numero di campioni possa essere analizzato in parallelo. Usando questa analisi, abbiamo selezionato una libreria razionalmente progettata del soppressore-tRNAs per migliorare l’efficienza del sistema ortogonale Pyl30. Quest’opera descrive il protocollo sperimentale per eseguire questo test e mostrare esempi della sua applicazione, tra cui l’ottimizzazione della coppia ortogonale per l’incorporazione della foto-reticolazione ncAA p-azido-L-fenilalanina (Azi) e il confronto delle efficienze di incorporazione degli aminoacidi diversi (Figura 2).

Negli ultimi anni, strumenti ncAA si sono dimostrati molto potente per studiare strutturali e gli aspetti funzionali di proteine G accoppiate recettori (GPCR)33,34,35,36,37 , 38. in esseri umani, GPCR formano una grande famiglia di recettori di membrana (800 membri) e rappresentano i principali bersagli per farmaci terapeutici. Caratterizzazione strutturale diretto dei GPCR è comunque impegnativo e complementari metodi biochimici altamente sono necessari per le indagini. Abbiamo sperimentato l’uso di foto-reticolazione ncAAs per mappare le superfici GPCR e scoprire ligand binding tasche34. Utilizzando il nostro sistema ottimizzato per l’incorporazione di Azi, abbiamo incorporato sistematicamente Azi in tutto il dominio di juxtamembrane tutta di un GPCR direttamente in streaming in cellule di mammifero. All’irradiazione UV, Azi forma una specie di nitrene altamente reattivo che cattura covalentemente molecole vicine. Quando il ligando viene aggiunto al sistema, Azi funge da una sonda di prossimità per rivelare quali posizioni del recettore si avvicina il ligando associato. In questo modo, la modalità di associazione dell’ormone neuropeptide urocortina (Ucn1) sul ricevitore di classe B GPCR corticotropin-releasing-factor tipo 1 (CRF1R)33 in primo luogo è stata presentata. Ultimamente, abbiamo divulgato modelli distinti associazione di agonisti ed antagonisti sullo stesso recettore38. Un approccio simile è stato applicato da altri per rivelare ortosterici e siti di legame allosterico di altri peptidi e ligandi di piccola molecola altri GPCR39,40,41,42. Questo manoscritto descrive il protocollo sperimentale applicato nel nostro laboratorio per foto-reticolazione mappatura delle superfici GPCR. Il metodo è relativamente veloce, semplice e non richiede particolari attrezzature, cosicché è applicabile nei laboratori di biochimica standard. D’importanza, l’approccio fornisce un valido strumento non solo di identificare siti di legame del ligando dove scarseggiano i dati strutturali 3D, ma anche per integrare i dati esistenti in vitro con informazioni da recettori completamente traduzionalmente modificati nella ambiente fisiologico della cellula dal vivo.

Il recente sviluppo del romanzo ncAAs cuscinetto sul lato catena gruppi chimici adatti per ultraveloce privo di catalizzatore bioorthogonal chimica ha aperto la possibilità di installare fluorofori di ultima generazione per l’imaging di Super-risoluzione nelle proteine direttamente su live cellule2,43. Tali ancoranti chimici includono sforzata cyclooctyne SCOK14, biciclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17e trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 tra altri ncAAs che harboring un norbornene16,17,44 o Ciclopropene45,46 frazione. Ingombranti ncAAs per la bioorthogonal chimica sono incorporati da una variante di PylRS solitamente indicato come PylRSAF (che indica la mutazione Y271A e Y349F in M. barkeri PylRS), così come da altri ad hoc si è evoluto ncAARSs17 , 44. le ancore bioorthogonal reagiscono con tetrazine reagenti47 via cicloaddizione di Diels-Alder inversa elettrone-domanda di dare rendimenti elevati d’etichettatura entro pochi minuti43,48. Tuttavia, applicazione di questo approccio potente etichetta GPCR è stato impegnativo a causa di una bassa efficienza complessiva del sistema ortogonale di incorporazione ncAA. Utilizzando il nostro avanzato sistema di Pyl, recentemente abbiamo dimostrato ad alto rendimento incorporazione di tali aminoacidi GPCR e ultraveloce GPCR etichettatura sulla superficie delle cellule di mammiferi dal vivo30. Ricevitori con etichettati erano ancora funzionali, come hanno interiorizzato fisiologicamente attivando il recettore con un agonista. Il protocollo sperimentale per l’incorporazione di bioorthogonal ancore in GPCR e le seguenti operazioni di etichettatura sono descritti qui. Dotare i GPCR con fluorofori luminoso piccolo è il primo passo fondamentale verso lo studio delle dinamiche strutturali GPCR nella cella dal vivo tramite tecniche di microscopia avanzata.

Protocol

1. selezione basata sulla fluorescenza delle efficienze di incorporazione (Figura 1) Mantenere le cellule HEK293 nel mezzo dell’Aquila per volta di Dulbecco (DMEM; alto glucosio, glutamina 4mm, piruvato) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO2. Le cellule del seme il giorno prima di transfezione. Staccare le cellule per 5 min a 37 ° C in 0.05% tripsina/P…

Representative Results

Il contorno del dosaggio di fluorescenza è raffigurato nella Figura 1. Il dosaggio è impiegato in tre applicazioni. In primo luogo, un numero di varianti di tRNA per l’incorporazione di Lys(Boc) dalla coppia ortogonale Pyl vengono proiettato. Lys(BOC) è un amminoacido stericamente simile a Pyl. Come Pyl non è commercialmente disponibile, Lys(Boc) è comunemente usato come substrato standard per la PylRS. I tRNAs schermato si basano sul tRNAPyl….

Discussion

Il protocollo descrive un’analisi semplice e affidabile per valutare l’efficienza di coppie ortogonali per l’incorporazione di ncAAs in proteine espresse nelle cellule di mammifero. Il principale vantaggio di questo metodo rispetto al diffusi saggi basati sulla FACS è che permette la preparazione simultanea e la misurazione di un più grande numero di campioni e fornisce i dati che sono facilmente analizzati utilizzando un software ordinario. La disponibilità di un metodo di media-velocità di trasmissione per analizza…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Quest’opera è stata fondata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) sotto sovvenzioni CO822/2-1 (programma di Emmy Noether) e CO822/3-1 a I.C.

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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