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Chimie

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr) を研究への応用を説明します。

Abstract

遺伝的非正規アミノ酸 (ncAAs) 黄色停止コドン抑制を介して定款は、生細胞に直接人工プローブと反応性タンパク質をインストールするのには強力な手法です。各 ncAA はホストの有機体にインポートされる専用直交サプレッサー tRNA/アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS) ペアが組み込まれます。異なる ncAAs の取り込み効率大幅異なるできいくつかのケースで満足できます。直交ペアは AARS または tRNA のいずれかを操作することによって改善できます。ただし、tRNA や AARS の大規模なライブラリと死者/生きている選択方法を使用しての進化には哺乳類細胞で、可能ではありません。ここでは、哺乳類細胞における直交ペアの効率を評価するための簡易で堅牢な蛍光ベースの分析が表示されます。アッセイは、AAR/tRNA バリエーションそれなりの努力と合理的な時間内の数百数十をスクリーニングできます。ピロリシン直交系の効率を大幅に向上させる新しい Trna を生成するこのアッセイの使用説明は、ncAAs の G タンパク質の研究への応用とともに結合受容体 (Gpcr)、ncAA のオブジェクト挑戦しています。突然変異誘発。最初に、体系的に組み込むことで受容体の細胞外表面部分を通して光橋 ncAA、そのまま受容体の異なる配位子の結合部位は生細胞に直接マップされます。第二に、GPCR に最後の世代の ncAAs を組み込むこと、超高速触媒無料受容体の蛍光色素をラベル付けを発揮、bioorthogonal ひずみ昇格逆ディールス ・ アルダー付加環化反応 (SPIEDAC) 生きている細胞を悪用します。NcAAs できます一般に適用するには、そのサイズに個別に蛋白質をメソッドが関心を持つアプリケーションの数です。また、ncAA 定款は特別な装置を必要としないし、標準生化学研究所で簡単に実行されます。

Introduction

タンパク質化学プローブの遺伝的定款は、構造および動的な生細胞のネイティブ コンテキストに直接蛋白質機能の調査を促進する強力な手法です。今日では、非正規のアミノ酸 (ncAAs) 装備されて最も異なる化学グループの何百もの生合成1,2,3,4site-specifically タンパク質に組み込むことが。それらの間の 1 つを見つける写真されております5、写真ケージ6,7,8,9写真切替可能なアミノ酸10,などの感光性 ncAAs11, アミノ酸ベアリング緊張したアルケンとアルキン触媒無料 bioorthogonal 化学2,12,13,14,15,16 ,17, ダンシル18クマリン9,19, とプロダン20,21 fluorophores が付いて、運ぶアミノ酸およびアミノ酸として他の生物物理学的プローブを装備ポスト翻訳の修正1,2,3,4,22,23,24,25とも。

NcAA の遺伝のエンコーディングは、専用アミノ-アシル-tRNA-合成酵素 (AARS)、同種サプレッサー tRNA、通常リボソーム合成の際に黄色停止コドンに対応 ncAA を取り入れたペアで有効です。ncAARS/tRNA のペアは、ホストの有機体すなわち内因性のペアしないクロストークで直交になるように設計されています。技術は、原核生物と真核生物のホストと哺乳類に簡単に該当するセルの両方確立しました。哺乳類細胞における定款の ncAA のペアは 3 つの主要な直交システムに基づいています: B. 中等度好熱27 (Ec からチロシン琥珀サプレッサーによるエシェリヒア属大腸菌の26から TyrRS を組み合わせたチロシル システムTyrRS/Bst山芋ペア)、エシェリヒア属大腸菌ロイシル システム (EcLeuRS/tRNAルーCUAペア)6,18,28および古細菌由来ピロリジル システム (PylRS/tRNAPylペア)3、tRNApyl ブランドがあるという自然な琥珀色の抑制。一般に、各 ncAA は特殊な ncAARS によって認識されます。NcAA の構造に応じて、ncAARS は、いくつかの合成は、複数の ncAA を受け入れることができますがの TyrRS LeuRS や PylRS、進化を介して取得されます。

直交のペアは、単にプラスミッドのベクトルを使用して、セルにインポートされます。最も一般的かつ効率的なプラスミドは bicistronic であり、合成酵素と直交ペア29を形成する tRNA の両方をエンコードします。変更用に指定されたサイトで琥珀のコドンを軸受興味の蛋白質のための第 2 プラスミド エンコーディングは cotransfected です。NcAA は細胞成長培地に単に追加されます。ただし、異なる専門のグループはしばしば同じ ncAA の体用もプラスミドの構造のさまざまなバリエーションを使用します。ベクトル合成酵素の種類、コドン使用合成酵素遺伝子、プロモーターの使い方、tRNA と tRNA 式カセット数のバリアントの遺伝子配列で構造が異なります。さらに、異なる ncAAs の取り込み効率は、異なるシンテターゼ、品質、tRNA および他の要因の30の異なる触媒効率のため大幅に変更できます。したがって、それは手で直交ペア、全体的な蛋白質の表現を向上させるいくつかの最適化のステップを実行して、目的のアプリケーションに最も適したシステムを選択する両方の効率を評価する高速で信頼性の高いメソッドを持つことが重要得られます。

直交ペア29 (図 1) の効率を評価するためのシンプルで堅牢な蛍光ベースのアッセイを設けています。アッセイ、細胞が一緒にレポーターの bicistronic プラスミド寛容な位置 (EGFPタグ) 黄色停止コドンを軸受緑色蛍光タンパク質の両方をエンコードの直交ペアのプラスミッドのエンコーディングで cotransfected とmCherry 遺伝子。全体セル lysates の赤と緑の蛍光プレート リーダー、96 ウェル プレートでの独立したチャンネルで読み取られます。赤い蛍光性の強度は、測定サンプルとトランスフェクション効率のサイズの直接推定値を与えるに対し、緑の蛍光性の強度は直接琥珀色の抑制の効率と相関します。蛍光に基づいて同様の試金に関してアシスト セル (FACS) を並べ替え読み上げる31,32アッセイは、詳細セル全体の人口でタンパク質発現の包括的な評価を与える通常の実験条件の代表的な容易なデータ取得と標準ソフトウェアによる処理を提供しています。全体的に、アッセイの主な利点は、サンプル数が多いために、媒体は並行して分析できます。この試金を使用して、Pyl 直交系30の効率を向上させるサプレッサー Trna の合理的に設計されたライブラリを上映しました。この作品は、この分析を実行し、光橋 ncAA p アジドフェニル-L-フェニルアラニン (ウェット) 定款の直交ペアの最適化との比較など、応用事例を示す実験的プロトコルをについて説明します種類のアミノ酸 (図 2) の取り込み効率。

最後の年に ncAA のツールは非常に強力な構造を調査する実証されているし、G タンパク質の機能的な側面結合受容体 (Gpcr)33,34,35,36,37,38. ヒトでは、Gpcr 膜受容体 (800 人) の大家族を形成し、治療薬の主なターゲットを表しています。Gpcr の直接構造解析まだやりがいや補完的な生化学的手法が非常に彼らの調査のため必要があります。我々 が GPCR にサーフェスをマップし、リガンド結合ポケット34を発見光橋 ncAAs の使用の先駆者します。シュワンツの混入のための最適なシステムを使用して、我々 は体系的に生きている哺乳類セルに直接 GPCR の全体細胞ドメイン全体シュワンツを設立しました。UV 照射、シュワンツは近隣の分子が共有結合キャプチャ ナイトレンと反応性の高い種を形成します。リガンドをシステムに追加すると、シュワンツは受容体の位置に近づくバインドされたリガンドを明らかにするための近接プローブとして機能します。このように、神経ペプチド ホルモン私 (Ucn1) クラス B GPCR 副腎皮質刺激ホルモン-放出-因子受容体のタイプ 1 (CRF1R)33 Urocortin のバインディング モード初披露。最近、アゴニスト及びアンタゴニストの同じ受容体38の異なるバインドのパターンを開示しました。同様のアプローチは、orthosteric と他のペプチドや他の Gpcr の39,の40,41,の42の小分子リガンドのアロステリック結合部位を明らかにする他のユーザーによって適用されています。本稿では、光橋 GPCR 表面のマッピングの研究室において実験的プロトコルについて説明します。メソッドは、比較的高速な簡単なと標準生化学演習で適用されるように特別な装置を必要としません。重要なは、立体構造データが不足しており、リガンド結合部位を特定するだけでなく、またファーストクリーニング完全に変更された受容器からの情報を既存の in vitroデータを補完する貴重なツールを提供するアプローチ、生細胞の生理学的な環境。

新規の ncAAs 側鎖化学グループ超高速触媒無料 bioorthogonal 化学に適した軸受の最近の開発は蛋白質に超解像イメージングの最後の世代の蛍光物質をインストールする可能性を開いたライブで直接細胞の2,43を実行します。このようなケミカル アンカーは、緊張した cyclooctyne SCOK14BCNK12,17ビシクロ [6.1.0] nonyne と TCO のトランス cyclooctenes * K13,15,17他の ncAAs の間でノルボルネン16,17,44またはシクロプロペン45,46基をかくまっています。かさばる ncAAs bioorthogonal 化学 PylRSAFとして通常示される PylRS の変形によって組み込まれている (突然変異を示す Y271A、 M. barkeriの PylRS の Y349F)、その他アドホック進化 ncAARSs17よると同様,44. bioorthogonal アンカーがいくつ分43,48ラベリング高利回りを与える逆電子需要ディールス ・ アルダー付加環化反応による tetrazine 試薬47と反応します。ただし、直交の ncAA 設立システムの全体的な効率が低いため Gpcr のラベルにこの強力なアプローチの応用にチャレンジしております。私たちの強化された Pyl のシステムを使用して、我々 は最近 Gpcr と超高速 GPCR は、生きている哺乳類セル30の表面上のラベルにこのようなアミノ酸の高収率定款を実証しました。ラベル付けされた受容体の通り彼らは生理学的アゴニストの受容体を活性化時に内面のまだ機能している。Bioorthogonal 定款の実験的プロトコルが Gpcr に固定し、ラベリング手順をここで説明します。小さな明るい fluorophores が付いている Gpcr で装備は、高度な顕微鏡技術を介して生きているセルの GPCR の構造ダイナミクスの研究に向けた最初の基本的なステップです。

Protocol

1. 結合効率 (図 1) の蛍光ベースのスクリーニング ダルベッコ変更イーグル培地で HEK293 細胞を維持 (DMEM; 高グルコース、4 mM グルタミン、ピルビン酸) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン 37 ° C、湿度 95% および 5% CO2で 100 μ g/mL ストレプトマイシンと補われます。 種細胞のトランスフェクション前日。 0.05 %0.5 mM EDTA を添加したトリ?…

Representative Results

蛍光アッセイの概要は、図 1に描かれています。アッセイは、3 つのアプリケーションで採用されています。まず初めに、Pyl 直交ペアで Lys(Boc) の定款の tRNA の亜種の数は除かれます。Lys(Boc) は、アミノ酸立体 Pyl のようです。Pyl は市販、Lys(Boc)、PylRS の標準的な基板として使用されます。選別された Trna を tRNA に基づくpyl ブランド。そ?…

Discussion

プロトコルでは、直交ペアの ncAAs の哺乳類細胞で発現したタンパク質混入の効率を評価するためにシンプルで信頼性の高いアッセイについて説明します。FACS に基づいて広く使用されているアッセイを尊重しこの方法の主な利点は同時準備と多数のサンプルの測定を可能にしては簡単に普通のソフトウェアを使用して分析データを提供します。哺乳類細胞における直交ペアを分析する媒体ス?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は CO822/2-1 (Emmy Noether プログラム) と CO822/3-1 陽性の補助金の下で、ドイツ研究振興協会 (DFG) によって設立されました。

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
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Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
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