JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Chimie

Optimalisere genetisk inkorporering av kjemiske sonder i GPCRs for foto-crosslinking kartlegging og Bioorthogonal kjemi i Live pattedyrceller

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

En lettvinte fluorescens analysen er presentert for å evaluere effektiviteten av amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA omfatter ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i proteiner i pattedyrceller. Bruk av ncAAs å studere G-protein kombinert reseptorer (GPCRs) er beskrevet, inkludert Foto-crosslinking tilordning av bindende områder og bioorthogonal GPCR merking på levende celler.

Abstract

Genetisk inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) via rav stopp codon undertrykkelse er en kraftfull teknikk installere kunstige sonder og reaktive moieties på proteiner direkte i live cellen. Hver ncAA er innarbeidet med en dedikert ortogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) par som importeres inn i verten organisme. Inkorporering effektiviteten av forskjellige ncAAs varierer sterkt, og være tilfredsstillende i noen tilfeller. Ortogonale par kan forbedres ved å manipulere AARS eller i tRNA. Men regissert utviklingen av tRNA eller AARS store biblioteker og døde/levende utvalg metoder er ikke gjennomførbart i pattedyrceller. Her vises en lettvinte og robust fluorescens-baserte analysen å evaluere effektiviteten av ortogonale par i pattedyrceller. Analysen kan screening titalls til hundrevis av AARS/tRNA varianter med en moderat innsats og innen rimelig tid. Bruk av denne analysen til å generere nye tRNAs som forbedrer effektiviteten av pyrrolysine ortogonale betydelig er beskrevet, sammen med bruk av ncAAs til studiet av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs), som er utfordrende objekter for ncAA mutagenese. Først, ved å systematisk innlemme en foto-crosslinking ncAA gjennom ekstracellulære overflaten av en reseptor, bindende områder av forskjellige ligander på intakt reseptoren tilordnes direkte i live cellen. Andre, ved å innlemme siste generasjons ncAAs i en GPCR, lynraske katalysator-fri reseptor merking med et fluorescerende farge er bevist, som utnytter bioorthogonal belastning forfremmet omvendt Diels or cycloaddition (SPIEDAC) på den levende cellen. Som ncAAs kan generelt brukes til alle protein i størrelse, er metoden av generell interesse for en rekke applikasjoner. I tillegg ncAA innlemmelse krever ikke spesialutstyr og utføres enkelt i standard biokjemi laboratorier.

Introduction

Genetisk inkorporering av kjemiske sonder i proteiner er en kraftig metode å lette etterforskningen av strukturelle og dynamisk aspekter av protein funksjonen direkte i opprinnelige kontekst av levende celle. I dag, kan hundrevis av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) utstyrt med de mest ulike kjemiske gruppene site-specifically innlemmet i proteiner av biosyntesen1,2,3,4. Mellom dem, finner man Foto-sensitive ncAAs som Foto-crosslinkers5, foto-bur6,7,8,9 og foto-valgbar aminosyrer10, 11, aminosyrer anstrengt alkener og alkynes for katalysator-fri bioorthogonal kjemi2,12,13,14,15,16 ,17, aminosyrer bærer dansyl18, kumarin9,19og prodan20,21 fluorophores og aminosyrer utstyrt med andre Biofysiske sonder som godt som med innlegg translasjonsforskning modifikasjoner1,2,3,4,22,23,24,25.

Genetiske kodingen av en ncAA aktiveres som en dedikert amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) koblet til en beslektet suppressor-tRNA, som inkorporerer ncAA svar på en gul stopp codon under vanlige ribosomal syntese. ncAARS/tRNA par er konstruert for å være ortogonale i verten organisme, altså ikke cross-talk med endogene parene. Teknikken er godt etablert både i prokaryotic og eukaryotic verter og lett gjelder pattedyr celler. Par for ncAA innlemmelse i pattedyrceller er basert på tre viktigste ortogonale systemer: tyrosyl systemet, som kombinerer TyrRS E. coli26 med en tyrosyl rav suppressor fra B. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstYam par), E. coli leucyl system (EcLeuRS/tRNALeuCUA par)6,18,28 og archaeal pyrrolysyl system (PylRS-tRNA- Pyl par)3, der tRNAPyl er en naturlig rav suppressor. Generelt, gjenkjennes hver ncAA av en spesialisert ncAARS. Avhengig av ncAA struktur, er ncAARS innhentet via regissert utviklingen av TyrRS, LeuRS eller PylRS, selv om noen synthetases kan godta flere ncAA.

Ortogonale paret importeres inn i cellene ved å bruke en plasmider vektor. Mest vanlige og effektive plasmider er bicistronic og kode både i synthetase og tRNA danner ortogonale par29. En andre plasmider koding for protein av rentebærende et gult codon på stedet angitt for endring er co transfekterte. NcAA legges bare til celle vekst medium. Imidlertid bruker forskjellige spesialiserte grupper ofte ulike varianter av plasmider konstruksjoner for inkorporering av samme ncAA. Konstruksjoner varierer i ordningen av gener i vektor, type av synthetase, codon bruk i synthetase genet, formidler bruk, variant av tRNA og antall tRNA uttrykk kassetter. Videre kan innlemmelse effektiviteten av forskjellige ncAAs variere drastisk på grunn av ulike katalytisk effektiviteten av de forskjellige synthetases, kvaliteten på tRNA og andre faktorer30. Derfor er det viktig å ha på hånden en rask og pålitelig metode for å vurdere effektiviteten av et ortogonale par, både å velge det mest passende systemet for et ønsket program og utføre noen optimering skritt som forbedrer generell protein uttrykk gir.

Vi har etablert en enkel og robust fluorescens-baserte analysen for å evaluere effektiviteten av ortogonale par29 (figur 1). I analysen, cellene er co transfekterte med plasmider koding for ortogonale paret, sammen med en bicistronic reporter plasmider koding både for grønne fluorescerende protein bærer en gul stopp codon på en ettergivende posisjon (EGFPTAG) og mCherry gene. Rød og grønn fluorescens av hele celler lysates leses i separate kanaler på en plate leser i en 96-brønns plate. Intensiteten av den grønne fluorescensen direkte korrelerer med effektiviteten av rav undertrykkelse, mens intensiteten av rød fluorescens gir en direkte anslag over størrelsen på målt prøven og transfection effektiviteten. Med hensyn til lignende analyser basert på fluorescens lese assistert celle sortering (FACS) ut31,32, analysen gir en umiddelbar og omfattende vurdering av protein uttrykk i befolkningen hele cellen, som er mer representant for vanlige eksperimentelle forhold, og tilbyr en enklere datainnsamling og prosessering programvare. Samlet er den største fordelen med analysen som et medium til et stort antall prøver kan bli analysert i parallell. Bruker denne analysen, har vi vist et rasjonelt utformet bibliotek med suppressor-tRNAs for å effektivisere Pyl ortogonale systemet30. Dette verket beskriver eksperimentelle protokollen for å utføre denne analysen og viser eksempler på programmet, inkludert optimalisering av ortogonale paret inkorporering av den Foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanin (Azi) og sammenligning av inkorporering effektiviteten av ulike aminosyrer (figur 2).

De siste årene, ncAA verktøy har vist seg svært kraftig undersøke strukturelle og funksjonelle aspekter av G-protein kombinert reseptorer (GPCRs),33,,34,,35,,36,,37 , 38. hos mennesker, GPCRs danner en stor familie membran reseptorer (800 medlemmer) og representerer viktigste mål for terapeutisk narkotika. Direkte strukturelle karakterisering av GPCRs er fortsatt utfordrende og komplementære biokjemiske metoder er svært nødvendig for etterforskningen. Vi har banebrytende bruk av foto-crosslinking ncAAs kartet GPCR overflater og oppdage ligand binding lommer34. Bruker systemet vårt er optimalisert for Azi innlemmelse, innlemmet vi systematisk Azi gjennom hele juxtamembrane domenet for en GPCR direkte i live pattedyrceller. På UV bestråling danner Azi en svært reaktive nitrene arter som covalently fanger nærliggende molekyler. Når ligand legges til systemet, fungerer Azi som en nærhet sonde å avsløre posisjoner av reseptoren komme nær bundet ligand. På denne måten ble bindingsmodus av neuropeptide hormone Urocortin jeg (Ucn1) på klasse B GPCR corticotropin-slippe-faktor reseptoren type 1 (CRF1R)33 først lansert. I det siste har vi avslørte distinkte bindende bruksmønstre agonister og motstanderne på det samme reseptor38. En lignende tilnærming har blitt brukt av andre å avsløre orthosteric og allosteric bindende områder av andre peptider og små molekyl ligander på andre GPCRs39,40,41,42. Dette manuskriptet beskriver eksperimentelle protokollen anvendt i vår lab for foto-crosslinking tilordning av GPCR overflater. Metoden er relativt rask, enkel og krever ikke spesielt utstyr, slik at det er aktuelt i standard biokjemi laboratorier. Viktigere, tilnærmingen gir et verdifullt verktøy ikke bare å identifisere ligand binding områder der 3D strukturelle data er mangelvare, men også å komplettere eksisterende i vitro data med informasjon fra fullt post-translationally endret reseptorer i den fysiologiske miljø i live cellen.

Den siste utviklingen av romanen ncAAs betydning siden kjeden kjemiske gruppene egner for superrask katalysator-fri bioorthogonal kjemi har åpnet opp muligheten til å installere siste generasjons fluorophores for super-oppløsning bildebehandling i proteiner direkte på live celler2,43. Slike kjemiske ankere inneholde anstrengt cyclooctyne i SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne i BCNK12,17, og trans-cyclooctenes i TCO * K13,15,17 blant andre ncAAs skjuler en norbornene16,17,44 eller cyclopropene45,46 moiety. Store ncAAs i bioorthogonal kjemi er innlemmet ved en variant av PylRS vanligvis merket som PylRSAF (som angir mutasjon Y271A og Y349F i M. barkeri PylRS), så vel som av andre ad hoc utviklet ncAARSs17 , 44. bioorthogonal ankere reagere med tetrazine reagenser47 via omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition å gi høy merking avkastning innen et par minutter43,48. Men har anvendelsen av denne kraftige tilnærmingen til etiketten GPCRs vært utfordrende på grunn av en lav virkningsgraden i ortogonale ncAA innlemmelse systemet. Bruke vår forbedrede Pyl system, har vi nylig vist høy dekkevne innlemmelse av slike aminosyrer i GPCRs og lynraske GPCR merking på overflaten av live pattedyrceller30. Merket reseptorer var fremdeles funksjonell, som de fysiologisk internalisert på aktivere reseptoren med en Agonistiske. Eksperimentell protokollen for inkorporering av bioorthogonal plugger i GPCRs og merking følgende beskrives her. Utstyre GPCRs med små lyse fluorophores er det første grunnleggende skrittet mot studiet av GPCR strukturelle dynamikken i live cellen via avanserte mikroskopi teknikker.

Protocol

1. fluorescens-basert Screening av inkorporering effektivitet (figur 1) Opprettholde HEK293 celler i Dulbeccos endret Eagle’s Medium (DMEM; høy glukose, 4 mM glutamin, pyruvate) med 10% (v/v) fetal bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin på 37 ° C, 95% fuktighet og 5% CO2. Frø cellene dagen før transfection. Koble celler for 5 min på 37 ° C i 0,05% Trypsin/PBS supplert med 0,5 mM EDTA. Bruk 1 mL Trypsin/EDTA for en 10 cm…

Representative Results

Omrisset av fluorescens analysen er avbildet i figur 1. Analysen er ansatt i tre programmer. I første omgang, er et antall tRNA varianter for innlemmelse av Lys(Boc) av Pyl ortogonale paret vist. Lys(Boc) er en aminosyre som er sterically lik Pyl. Som Pyl ikke er kommersielt tilgjengelig, brukes Lys(Boc) vanligvis som en standard substrat for PylRS. Vist tRNAs er basert på tRNAPyl. Hver tRNA variant bærer mutasjoner enkelt baser eller base-paren…

Discussion

Protokollen beskriver en enkel og pålitelig analysen for å vurdere effektiviteten av ortogonale for inkorporering av ncAAs proteiner i pattedyrceller. Den største fordelen med denne metoden gjelder brukte analyser basert på FACS er at det tillater samtidig forberedelse og måling av større antall prøver, og gir data som analyseres enkelt ved hjelp av en vanlig programvare. Tilgjengeligheten av en medium gjennomstrømming metode for å analysere ortogonale par i pattedyrceller er svært viktig for utviklingen av nye…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet er grunnlagt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) under tilskudd CO822/2-1 (Emmy-Noether program) og CO822/3-1 til IC

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochimie. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chimie. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/fr/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image