JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57069
, , ,
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences,University of Leipzig

Summary

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Abstract

Kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) yolu ile amber stop kodonu bastırma genetik birleşme yapay sonda ve reaktif moieties proteinleri üzerine doğrudan canlı hücre içinde yüklemek için güçlü bir tekniktir. Her ncAA ana bilgisayar organizma ithal bir adanmış ortogonal bastırıcı-tRNA/amino-asil-tRNA-sentetaz (AARS) çifti tarafından kurulmuştur. Farklı ncAAs birleşme verimliliğini büyük ölçüde farklılık gösterebilir ve bazı durumlarda yetersiz. Ortogonal çiftleri AARS veya tRNA manipüle ederek geliştirilebilir. Ancak, yönlendirilmiş evrim tRNA veya büyük kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yöntemlerini kullanarak AARS değildir uygun memeli hücrelerinde. Burada, dik memeli hücreleri çiftinde verimliliğini değerlendirmek için bir facile ve sağlam Floresans tabanlı tahlil sunulur. Tahlil onlarca AARS/tRNA değişik bir orta çaba ile ve makul bir süre içinde yüzlerce tarama sağlar. Kullanım pyrrolysine ortogonal sisteminin performansını önemli ölçüde artıran yeni tRNA oluşturmak için bu testin anlatılan, ncAAs uygulamaya G-protein çalışmanın yanı sıra nesneleri ncAA için zorlu reseptörleri (GPCRs), birleşince mutagenesis. İlk olarak, sistematik bir reseptör ekstraselüler yüzeyi boyunca fotoğraf-crosslinking ncAA birleşmeyle, bozulmamış reseptör üzerinde farklı ligandlar bağlama siteleri doğrudan canlı hücre içinde eşleştirilir. İkinci, son nesil ncAAs bir GPCR birleşmeyle, floresan bir boya ile ultrafast katalizör-Alerjik reseptör etiketleme, hangi bioorthogonal zorlanma terfi ters Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) canlı hücre üzerinde olağanüstü başarı gösterilmiştir. NcAAs genellikle herhangi bir protein boyutuna üzerinde bağımsız olarak uygulanabilir gibi uygulamalar için genel ilgi yöntemidir. Buna ek olarak, ncAA birleşme herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve standart Biyokimya laboratuvarlarında kolayca gerçekleştirilir.

Introduction

Kimyasal probları genetik birleşme proteinlerin içine protein işlevi doğrudan canlı hücre yerli bağlamında yapısal ve dinamik yönleriyle incelenmesi kolaylaştırmak için güçlü bir yöntemdir. Günümüzde, kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) en farklı kimyasal gruplar ile donatılmış yüzlerce site-specifically protein biyosentezi1,2,3,4tarafından eklenebilir. Aralarında, bir fotoğraf-crosslinkers5, fotoğraf Kafesli6,7,8,9 ve fotoğraf değiştirilebilir amino asitler10, gibi fotoğraf duyarlı ncAAs bulur 11, amino asitler taşıyan gergin alkenes ve alkynes catalyst-Alerjik bioorthogonal kimya2,12,13,14,15,16 ,17, dansyl18, coumarin9,19ve prodan20,21 fluorophores taşıyan amino asitleri ve amino asitler biyofiziksel diğer probları ile donatılmış sonrası translasyonel modifikasyonlar1,2,3,4,22,23,24,ile25gibi iyi.

Genetik bir ncAA kodlama bir adanmış amino-asil-tRNA-ncAA yanıt olarak bir kehribar kodonu düzenli ribozomal sentezi sırasında birleştirmek soydaş bir bastırıcı-tRNA için eşleştirilmiş sentetaz (AARS) tarafından etkinleştirilir. ncAARS/tRNA çiftleri konak canlı, Yani değil çapraz-endojen çiftiyle hadis dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik ana bilgisayarlar ve kolayca uygulanabilir memeli hücreleri hem de iyi kurulmuş bir tekniktir. Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için çift üç ana ortogonal sistemlerinde temel alır: E. coli26 TyrRS bir tyrosyl amber bastırıcı B. stearothermophilus27 (Ec ile birleştiren tyrosyl sistemi TyrRS /BstYam çift), E. coli leucyl sistemi (EcLeuRS/tRNALeuCUA çifti)6,18,28 ve arke pyrrolysyl sistemi (PylRS/tRNA Pyl çifti)3, tRNAPyl bu sayede doğal kehribar bastırıcı. Genel olarak, her ncAA tarafından özel bir ncAARS tanınır. Her ne kadar bazı sentetaz birden fazla ncAA kabul edebilir ncAA yapısına bağlı olarak, ncAARS TyrRS, LeuRS veya PylRS, yönlendirilmiş evrim elde edilir.

Ortogonal çifti sadece bir plazmid vektör kullanarak hücre içine alınır. En yaygın ve etkin plazmid ortogonal çifti29şekillendirme tRNA sentetaz hem de encode ve bicistronic vardır. Kodlama değişikliği için belirlenmiş sitesinde bir kehribar kodon faizli protein için ikinci plazmid co transfected. NcAA sadece hücre büyüme ortamına eklenir. Ancak, farklı özel gruplar genellikle plazmid yapıları farklı türevleri bile aynı ncAA birleşme için kullanın. Düzenleme vektör, sentetaz türünü, kodon kullanım sentetaz gen, organizatörü kullanımı, değişken tRNA ve tRNA ifade kaset sayısı genlerin yapıları farklı. Ayrıca, farklı ncAAs birleşme verimliliği nedeniyle farklı katalitik verimini farklı sentetaz, tRNA ve diğer faktörler30kalitesini büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, el altında dik çiftinin en uygun sistemi için istediğiniz uygulamayı seçin ve genel protein ifade geliştirmek bazı optimizasyon adımları gerçekleştirmek için verimliliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem olması önemlidir verir.

Biz dik çiftleri29 (şekil 1) verimliliğini değerlendirmek için bir basit ve sağlam Floresans tabanlı tahlil kurduk. Assay olarak, plazmid ile birlikte her ikisi için bir kehribar kodonu izin veren bir konumda (EGFPetiketi) taşıyan yeşil flüoresan protein kodlama bicistronic muhabir plazmid ortogonal çifti için kodlama ile ortak transfected hücrelerdir ve mCherry gen. Bütün hücreli lysates kırmızı ve yeşil floresan bir plaka okuyucu bir 96-şey plaka üzerinde ayrı kanallarda okuyun. Kırmızı Floresans yoğunluğunu transfection etkinlik ve ölçülen örnek boyutunun doğrudan bir tahmin verir ise yeşil floresan yoğunluğu doğrudan kehribar giderme, verimliliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Floresans üzerinde dayalı benzer deneyleri ile ilgili olarak yardımlı hücre (FACS) sıralama okumak31,32, tahlil protein ifade acil ve kapsamlı bir değerlendirmesini daha fazla olan tüm cep telefonu topluluk içinde verir. Her zamanki deneysel koşullar, temsilcisi ve bir daha kolay veri toplama ve işleme standart yazılım ile sunmaktadır. Genel olarak, en büyük avantajı tahlil örnekleri çok sayıda orta paralel olarak analiz edilebilir olduğunu. Bu tahlil kullanarak, bastırıcı-tRNA Pyl ortogonal sistem30verimliliğini artırmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış bir kütüphane ekranlı. Bu eser bu tahlil gerçekleştirmek ve fotoğraf-crosslinking ncAA p-azido-L-fenilalanin (Polat) birleşme ortogonal çiftinin optimizasyonu ve karşılaştırılması gibi onun uygulama örnekleri göstermek için deneysel protokolünü açıklar birleşme verimliliği farklı amino asit (Şekil 2).

Geçen yıllar boyunca, yapısal araştırmak için çok güçlü kanıtlanmış ncAA araçları ve reseptörleri (GPCRs)33,34,35,36,37 G-protein fonksiyonel yönleri birleştiğinde , 38. insanlarda, GPCRs membran reseptörleri (800 üye) büyük bir aile oluşturmak ve tedavi edici ilaçlar için ana hedefleri temsil eder. GPCRs doğrudan yapısal karakterizasyonu hala meydan okuyor ve tamamlayıcı biyokimyasal yöntem son derece onların soruşturma için ihtiyaç vardır. Fotoğraf-çapraz ncAAs GPCR yüzeyler harita ve ligand bağlayıcı cepler34keşfetmek için kullanılmasına öncülük etmiştir. Polat birleşme için en iyi duruma getirilmiş sistemimizi kullanarak, biz sistematik olarak Polat GPCR canlı memeli hücrelerinde doğrudan, Bütün juxtamembrane etki alanı dahil. UV ışınlama Polat komşu molekülleri kovalent yakalar bir büyük ölçüde reaktif nitrene tür oluşturur. Ligand sisteme eklendiğinde, Polat hangi pozisyonlar reseptör ilişkili ligand yakın gel ortaya çıkarmak için bir yakınlık sonda olarak hizmet vermektedir. Bu şekilde, peptit hormon Urocortin ı (Ucn1) Sınıf B GPCR kortikotropin-serbest-faktör reseptör tarihinde 1 (CRF1R)33 tipi bağlama modu ilk açıldı. Son zamanlarda, farklı bağlama kalıpları agonistleri ve antagonistleri tarihinde aynı reseptör38ifşa. Benzer bir yaklaşım, orthosteric ve allosteric bağlayıcı siteleri diğer peptidler ve küçük molekül ligandlar tarihinde diğer GPCRs39,40,41,42ortaya çıkarmak için başkaları tarafından uygulanmıştır. Bu el yazması GPCR yüzeyler, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine bizim laboratuvarında uygulanan deneysel protokolünü açıklar. Yöntem nispeten hızlı, basit ve böylece standart Biyokimya laboratuvarlarında uygulanabilir herhangi bir özel bir donanım gerektirmez. Önemlisi, yaklaşım sadece 3D yapısal verileri nerede kıt ligand bağlayıcı siteleri tanımlamak için aynı zamanda tam olarak post-translationally tarihinde reseptörleri üzerinden bilgileriyle varolan vitro verileri ek olarak değerli bir araç sağlar canlı hücre fizyolojik ortamı.

Roman ncAAs yan zinciri kimyasal gruplarında ultrafast katalizör-Alerjik bioorthogonal Kimya için uygun taşıyan son gelişme olasılığı son nesil fluorophores süper kararlılık düşsel için protein yüklemek için açtı 2,43doğrudan canlı hücreleri. Bu tür kimyasal dübel gergin cyclooctyne dahil SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17ve trans-cyclooctenes toplam sahip olma maliyeti içinde * K13,15,17 diğer ncAAs arasında norbornene16,17,44 veya cyclopropene45,46 yan yataklık. Bioorthogonal kimya hantal ncAAs genellikle PylRSAF ile belirtilen PylRS varyanta göre dahil (mutasyon gösteren Y271A ve M. barkeri PylRS Y349F), yanı sıra diğer gelişti geçici ncAARSs tarafından17 gibi , 44. bioorthogonal çapa yüksek etiketleme verim içinde birkaç dakika43,48vermek için ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition via tetrazine reaktifler47 ile tepki. Ancak, uygulama için etiket GPCRs güçlü Bu yaklaşımın ortogonal ncAA birleşme sistem düşük bir genel verimliliğini nedeniyle zor oldu. Gelişmiş Pyl sistemimizi kullanarak, son zamanlarda yüksek verimli birleşme gibi amino asitler GPCRs ve ultrafast GPCR canlı memeli hücreleri30yüzeyinde etiketleme göstermiştir. Fizyolojik bir agonist ile reseptör aktif hale getirildiğinde içselleştirilmiş gibi etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Deneysel protokol bioorthogonal birleşme GPCRs tutturur ve aşağıdaki etiketleme adımları burada açıklanmıştır. GPCRs küçük parlak fluorophores ile donatılması ilk temel doğru GPCR yapısal dinamiklerin canlı hücredeki çalışma yolu ile gelişmiş mikroskobu teknikleri adımdır.

Protocol

1. Floresans tabanlı tarama birleşme verimliliği (şekil 1) Dulbecco’nın modifiye kartal orta HEK293 hücreleri korumak (DMEM; yüksek glikoz, 4 mM glutamin, pyruvate) % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile desteklenmiştir. Tohum hücreleri transfection önceki gün. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C’de 5 dakika ayır. 1 mL …

Representative Results

Floresans tahlil anahat şekil 1′ de tasvir edilir. Tahlil üç uygulamalarda istihdam edilmektedir. İlk etapta tRNA türevleri Lys(Boc) Pyl ortogonal çifti tarafından birleşme için bir dizi ekranlı. Lys(Boc) Pyl için sterically benzer bir amino asittir. Pyl ticari olarak mevcut olmadığı gibi Lys(Boc) standart bir substrat PylRS için yaygın olarak kullanılır. Filtrelenmiş tRNA tRNA üzerinde temel alanPyl. Her tRNA değişken tek üs…

Discussion

Protokol ncAAs birleşme memeli hücrelerinde proteinlerin içine dik çiftleri verimliliğini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir tahlil açıklar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan deneyleri FACS üzerinde dayalı açısından büyük avantajı bu eşzamanlı hazırlanması ve örnekleri daha büyük sayıda ölçüm sağlar ve kolayca sıradan bir yazılım kullanılarak analiz veri sağlar olduğunu. Dik memeli hücreleri çiftinde analiz etmek için bir orta-den geçerek yöntem kullanılabilirliği me…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe CO822/2-1 (Emmy Noether programı) ve CO822/3-1 için araç ten altında kurulan

Materials

Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3) [Quelle Laborjounal]
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal [Turnbull]
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal [Turnbull]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochimie. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chimie. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Tags

GPCRPhoto-crosslinkingBioorthogonal ChemistryNon-canonical Amino AcidsAmber Codon SuppressionFluorescence AssayMammalian CellsProtein-protein InteractionsLigand BindingLive Cell Imaging
check_url/fr/57069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image