تنمية بروتينات المؤتلف لعلاج الألم المزمن
Summary
أننا في هذه الورقة تقديم تفاصيل لأساليب الإنتاج ومراقبة الجودة البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10. نعرض أيضا كيفية اختبار فعالية هذا البروتين لحل الألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية.
Abstract
من الصعب علاج الألم المزمن، وهناك حاجة ماسة إلى نهج جديدة لحل الألم المستمر. السيتوكينات المضادة للالتهابات هي المرشحين الواعدين لعلاج الحالات ألم المنهكة بسبب قدرتها على تنظيم التفاعلات المناعية العصبية الشاذة. بيد أن الناحية الفسيولوجية وهي تعمل في شبكة السيتوكينات المختلفة وذلك قد لا يكون تأثيرها العلاجي الأمثل عند استخدامها كالمخدرات ذاتها. للتغلب على هذا التحديد، قمنا بتطوير بروتين انصهار السيتوكينات المضادة للالتهابات IL4 و IL10. هنا، يمكننا وصف الأساليب للإنتاج ومراقبة الجودة من البروتين الانصهار المؤتلف IL4-10 ونقوم باختبار فعالية البروتين الانصهار IL4-10 لحل ألم في نموذج الفأر من الألم التحريضية المستمرة.
Introduction
الألم المزمن لا تزال واحدة من المشاكل الطبية الأكثر المنهكة والمعالجة بموجب القرن الحادي والعشرين، التي تمس > 20 في المائة من السكان البالغين1،2. ومع ذلك، علاجات لتقديم الإغاثة من الألم المزمن غالباً ما تكون غير فعالة أو يجب أن توقف بسبب الآثار الجانبية الحادة3. الأهم من ذلك، حاليا الأدوية المتاحة فقط توفير تخفيف الأعراض، ولكن ليس إلى حد كبير تعديل أو علاج الألم المزمن. على الرغم من أن الألم المزمن، على ما يبدو، اضطراب عصبي، تشير الأدلة إلى تورط الجهاز المناعي في الألم المزمن التنمية4،5. وعلاوة على ذلك، تبرز النهج المستندة إلى جهاز المناعة لعلاج الألم. على سبيل المثال، السيتوكينات المضادة للالتهابات تمنع الألم في عدة نماذج من الألم المزمن6،،من78. ومع ذلك، قد السيتوكينات المضادة للالتهابات نصف عمر قصيرة، الحد من آثارها المحتملة التي تحول دون الألم. وعلاوة على ذلك، تعمل السيتوكينات المضادة للالتهابات الأكثر على النحو الأمثل في تناسق مع بعضها البعض. للتغلب على هذه القيود، ونحن مؤخرا تنصهر السيتوكينات المضادة للالتهابات انترلوكين-4 (IL4) وانترلوكين-10 (IL10) في جزيء واحد. يظهر البروتين الانصهار IL4-10 كفاءة متفوقة في تثبيط الألم المزمن التحريضية والأعصاب مقارنة ب الفردية السيتوكينات9. هنا يصف لنا كيف يتم إنتاج هذا البروتين الانصهار، تنقية، وكيف يتم التحكم في الجودة.
وتنتج البروتين الانصهار IL4-10 في الخلايا البشرية عابر تعداء الخلايا و HEK293 مع ناقل تعبير بوب يحمل التسلسل كدنا ترميز البروتين الانصهار IL4-10. ويتم اختيار الخلايا و HEK293 لتسمح بتعديل بوستترانسلاشونال من البروتين، الأمر الذي لا يحدث في أنظمة تعبير البكتيرية. لتحسين وضع سقف جليكان مع حمض اللعابي، كدنا الترميز بيتا-جالاكتوسيدي-2، 3-سياليل-ترانسفيراز قد أدرج في الناقل التحوير ثاني. هو تنقية البروتين الانصهار باستخدام تنقية البروتين تقارب الثقافة طاف لأنها أقوى من تنقية بأساليب مثل حجم الاستبعاد أو التبادل الأيوني اللوني10،11أخرى. لتنقية البروتين الانصهار IL4-10، استخدمنا داخلية مونوكلونل الصنع ضد IL4. يتم إجراء تقييم لنقاء وبيواكتيفيتي لتنقية البروتين الانصهار IL4-10 كجزء من مراقبة الجودة. يتم تقييم نقاء دفعات المنتجة بالصوديوم دوديسيل كبريتات Polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، وارتفاع ضغط حجم الاستبعاد اللوني (إتش بي-ثانية). يتم تقييم بيواكتيفيتي البروتين الانصهار IL4-10 بقياس قدرته على تمنع lipopolysaccharide (LPS)-التي يسببها إنتاج عامل نخر الورم-ألفا (TNFα) في الثقافات الدم كله، ومقارنتها بالجمع بين الفرد السيتوكينات.
وأخيراً، من أجل اختبار قدرة IL4-10 الانصهار البروتينات تمنع الألم المزمن، يمكننا وصف كيف يمكن اختبار البروتين الانصهار كمسكن في نماذج الماوس المستخدمة على نطاق واسع من الألم التحريضية المستمرة12،13،14 . هنا يصف لنا أساليب نموذج الألم التحريضية. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن نماذج الألم أخرى يمكن استخدامها (مثلنماذج الأم الأعصاب)، اعتماداً على البحث الأسئلة التي تحتاج إلى إجابة. لتقييم الألم في هذه النماذج، من المهم أن استخدام مجموعة متنوعة من التدابير السلوكية التي تشمل آثار والتدابير غير أثارت الألم. هنا، يمكننا وصف أساليب التقييم للتغيرات في الاستجابة السلوكية مقولة ميكانيكيا وحراريا. يتم تقييم حساسية الميكانيكية للمحفزات حميدة باستخدام اختبار فراي فون، في حين يتم تقييم حساسية الحرارية باستخدام اختبار هارجريفز. الأهم من ذلك، يتم قياس غير أثارت هايبرالجيسيا/اللودينيا باستخدام اختبار “تحمل الوزن الحيوي”. هذه التدابير مقبولة على نطاق واسع كتدابير الألم وتسفر عن معلومات هامة عن عتبات الألم والألم محتملة تتعرض لها الحيوانات15،،من1617. أخرى تدابير لتقييم الألم غير أثارت (مثلاً، حافزا مستقلة)، مثل اختبار تفضيل المكان المكيفة، قد تكون قيمة18. لتقييم إمكانات المخدرات لتمنع الألم، أجرينا الإدارة إينتراثيكال من البروتين الانصهار، كما مع هذا الطريق من الإدارة أقل جرعة البروتين ضروري للوصول إلى المناطق ذات الصلة بالألم وتجنب الجهازية (الجانب) آثار19، 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذه المخطوطة أساليب للإنتاج وتوصيف المؤتلف IL4-10 الانصهار البروتين، وأساليب لاختبار فعاليته في منع التهاب هايبرالجيسيا في نماذج الماوس من الألم التحريضية المستمرة. إنتاج وتنقية البروتين الانصهار IL4-10 يتم على نطاق صغير. يتم تحديد الخلايا HEK293 كنظام لتعبير لإنتاج البروتين لأنها تمكن ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جزء من هذا العمل قد تم تمويلها “علوم الحياة” بجامعة أوتريخت منح
Materials
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
References
- Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
- Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
- Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
- Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
- Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
- Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
- Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
- Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
- Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
- Schott, H. . Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , (1984).
- Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , (2001).
- Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
- Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
- Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund’s Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
- He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
- Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
- Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
- Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
- Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).
