घुलनशील और अघुलनशील Huntingtin प्रजातियों के समाधान के लिए भिन्नीकरण
Summary
एक विधि माउस मस्तिष्क और कोशिका संस्कृति से अघुलनशील और घुलनशील उत्परिवर्ती huntingtin प्रजातियों के अंश के लिए वर्णित है । वर्णित विधि लक्षण वर्णन और huntingtin प्रोटीन प्रवाह और एड्स रोग रोगजनन में प्रोटीन homeostasis का विश्लेषण करने में और perturbations की उपस्थिति में ठहराव के लिए उपयोगी है
Abstract
Huntington के रोग (एचडी) और कई अन्य neurodegenerative विकारों में विकृति के लिए केंद्रीय प्रोटीन के संचय का केंद्र है । विशेष रूप से, HD के एक प्रमुख रोग सुविधा उच्च आणविक भार परिसरों में उत्परिवर्ती HTT (mHTT) प्रोटीन का ंयायपालिका संचय और टुकड़े और अन्य प्रोटीन से बना intracellular समावेश निकायों है । पारंपरिक तरीकों को मापने के लिए और mHTT-युक्त समुच्चय के विभिंन रूपों के योगदान को समझने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, पश्चिमी दाग विश्लेषण, और फिल्टर जाल परख शामिल हैं ।
हालांकि, इन तरीकों की सबसे विशिष्ट अनुरूप हैं, और इसलिए समग्र घुलनशीलता और संकल्प के जटिल प्रकृति के कारण mHTT प्रोटीन प्रवाह का पूरा राज्य हल नहीं हो सकता है ।
एकत्रित mHTT और विभिन्न संशोधित रूपों और परिसरों की पहचान के लिए, सेलुलर समुच्चय और टुकड़ों के पृथक्करण और solubilization अनिवार्य है । यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और घुलनशील mHTT, मोनोमर, oligomers, टुकड़े कल्पना, और एक अघुलनशील उच्च आणविक वजन (HMW) संचित mHTT प्रजातियों । HMW mHTT रोग प्रगति के साथ पटरियों, माउस व्यवहार readouts के साथ मेल खाती है, और लाभप्रद रूप से कुछ चिकित्सीय हस्तक्षेप द्वारा संग्राहक किया गया है1। इस दृष्टिकोण माउस मस्तिष्क, परिधीय ऊतकों, और कोशिका संस्कृति के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अंय मॉडल प्रणालियों या रोग संदर्भों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण नेटवर्क है कि उचित तह और सेलुलर प्रोटीन की गिरावट सुनिश्चित करने के व्यवधान अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एच. डी.), और अंय “प्रोटीन का खुलासा में विकृति के लिए केंद्रीय संभावना है” विकारों2,3. proteostasis नेटवर्क घटकों की एक विस्तृत समझ और विकृति के लिए उनके योगदान इसलिए सुधार चिकित्सकीय हस्तक्षेप विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । hd जीन के भीतर एक सीएजी दोहराने की असामांय विस्तार के कारण होता है polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) प्रोटीन4में एक विस्तारित खिंचाव के परिणामस्वरूप । HD रोगजनन की एक सुसंगत रोग सुविधा जिसके परिणामस्वरूप, संचय, और मस्तिष्क के क्षेत्रों में और परिधीय ऊतकों में HTT के एकत्रीकरण, जो सामान्य कोशिका homeostasis और समारोह के साथ कई मायनों में हस्तक्षेप करने के लिए दिखाया गया है 5 , 6. जबकि HTT बैरे व्यक्त की है, striatum में मध्यम कंटीला ंयूरॉंस चुनिंदा कमजोर कर रहे है और सबसे खुलकर उल्लेखनीय cortical भी HD रोगजनन के साथ जुड़े शोष के साथ प्रभावित ।
HD रोगियों और जानवरों के मॉडलों के मस्तिष्क में HTT के समुच्चय के गठन आम तौर पर रोग प्रगति और mHTT के लिए समारोह के प्रमुख नकारात्मक लाभ के लिए एक प्रॉक्सी मार्कर के रूप में सेवा की है7. हालांकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण mHTT-प्रेरित विषाक्तता में योगदान कर सकते हैं स्पष्ट नहीं रह, HD रोगियों और विभिन्न पशु मॉडलों के मस्तिष्क में इन समावेशियों के गठन एक अपरिवर्तनीय और अपरिहार्य विशेषता है. शामिल किए जाने के लिए मोटे तौर पर जमा HTT टुकड़े के शामिल एन टर्मिनल विस्तारित polyQ, संकेत है कि प्रोटियोलिसिस और पूर्ण लंबाई HTT के प्रसंस्करण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वैकल्पिक ब्याह8,9 खेल सकते हैं । HD. N-टर्मिनल HTT अंशों के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका HTT का एक रोग रूप का गठन कर सकती है जो एकत्रीकरण प्रक्रिया को तेजी से, nucleate, और तेज या प्रचारित कर सकते हैं10।
हालांकि, इन समावेशी की उपस्थिति जरूरी HTT-प्रेरित विषाक्तता या कोशिका मृत्यु11के साथ सहसंबंधी बनाना नहीं है । HTT घुलनशील oligomeric प्रजातियों और β-पत्रक तंतुओं के माध्यम से घुलनशील मोनोमर से एक एकत्रीकरण प्रक्रिया से गुजरना अघुलनशील समुच्चय और शामिल करने के लिए प्रस्तावित किया गया है12. मानक जैव रासायनिक परख के माध्यम से इन विभिंन प्रोटीन प्रजातियों को हल कम-डिटर्जेंट lysis बफर और मानक जैव रासायनिक परख का उपयोग visualizing में कठिनाई में उनके स्थायित्व के कारण क्षेत्र में एक चुनौती रही है । इस प्रकार, methodological विचार और संचित और एकत्रित mHTT की डिग्री और पैटर्न का पता लगाने में महत्वपूर्ण हैं ।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल HTT के कई मध्यवर्ती कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, विशेष रूप से HD रोगजनन और रोग प्रगति के साथ बारीकी से ट्रैक करने के लिए प्रकट होता है कि एक अघुलनशील HMW HTT प्रजातियों के गठन1,13 ,14. को हल करने और mHTT के कई प्रजातियों को ट्रैक करने में सक्षम होने के नाते एक जैव रासायनिक उपकरण रोग रोगजनन अध्ययन और रोग रोगजनन पर उनके मॉडुलन और प्रभाव के माध्यम से संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
उपर्युक्त प्रोटोकॉल के लिए कुछ सावधानियों की जरूरत के लिए संगत और मात्रात्मक परिणाम सुनिश्चित कर रहे हैं । सबसे पहले, दोनों भागों में mHTT अनायास कई फ्रीज गल चक्र पर समय के साथ समुच्चय फार्म होगा, विशेष र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH (RO1-NS090390) ने सपोर्ट किया था । हम भी डॉ Joan Steffanfor तकनीकी सहायता और इस परख के विकास के दौरान चर्चा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
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