가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

Summary

메서드는 마우스 두뇌와 셀 문화에서 불용 해 성과 녹는 돌연변이 huntingtin 종의 분류에 대 한 설명 되어 있습니다. 설명 하는 메서드는 특성화 및 정량화 huntingtin 단백질 플럭스와 단백질 항상성 질병 병 인에 고 섭의 존재를 분석 에이즈의

Abstract

Misfolded 단백질의 축적 중심 Huntington의 질병 (HD)에 병 리 그리고 많은 다른 신경 퇴행 성 질환입니다. 특히, HD의 주요 병 적인 특징은 높은 분자량 복합물으로 돌연변이 체 HTT (mHTT) 단백질의 탈 선 축적 하 고 세포내 포함 시체 조각 및 다른 단백질으로 구성. 기존의 방법 측정 하 고 이해 하는 다양 한 형태의 mHTT 포함 된 집계의 기여 등 형광 현미경 검사 법, 서쪽 오 점 분석, 필터 트랩 분석 실험.

그러나, 이러한 방법의 대부분 특정, 구조 이며 따라서 mHTT 단백질 유량 집계 용 해도 및 해상도의 복잡 한 특성의 전체 상태를 확인 하지 않을 수 있습니다.

집계 mHTT 및 다양 한 수정된 양식 및 단지의 식별, 분리 및 세포 집계 및 파편의 가용 화는 필수입니다. 여기 우리 녹는 mHTT, 단위체, 올리고, 조각, 시각화를 격리 하는 방법을 설명 하 고 있는 불용 성 고 분자량 (HMW) 축적 mHTT 종. HMW mHTT 추적 질병 진행, 마우스 동작 표시기와 해당 하며 특정 치료 개입¹군인이 변조 되었습니다. 이 방법은 마우스 뇌, 주변 조직 및 세포 배양 함께 사용할 수 있지만 다른 모델 시스템 또는 질병 상황에 적용할 수 있습니다.

Introduction

적절 한 접는 보장 하는 단백질 품질 관리 네트워크 장애 및 세포 단백질의 저하는 가능성이 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 병 리 및 다른 “단백질 misfolding” ^2,3장애. Proteostasis 네트워크 구성 요소와 병 리에 그들의 공헌에 대 한 자세한 이해는 그러므로 향상 된 치료 내정간섭을 개발 하는 중요 한. HD는 HD 유전자 huntingtin (HTT) 단백질⁴에서 polyglutamines (polyQ)의 확장 된 스트레칭 결과 내에서 CAG 반복의 비정상적인 확장에 의해 발생 합니다. HD pathogenesis의 일관 된 병 적인 기능이 이다는 결과 misfolding, 축적, 그리고 정상적인 세포 항상성 그리고 기능을 여러 가지 방법으로 방해를 표시 되었습니다 HTT 두뇌의 영역에서와 주변 조직에의 ^{5 , 6}. 동안 HTT 표현 편, 고가에 중간 가시 뉴런 선택적으로 취약 하 고 가장 명백 하 게 영향을 받는 주목할 만한 대뇌 피 질의 위축 또한 HD pathogenesis 연관.

HD 환자 및 동물 모델의 두뇌에 HTT의 집계의 형성 일반적으로 질병의 진행 및 지배적인 부정 이득의 mHTT⁷기능에 대 한 프록시 표식으로 봉사 했다. 비록 정확한 기계 장치는 단백질에 의해 misfolding와 집계 mHTT 유발 독성에 기여할 수 있습니다, 불분명 남아 있다 HD 환자와 다양 한 동물 모델의 뇌에서 이러한 흠도의 형성은 고정 하 고 피할 수 없는 기능입니다. 포함 표시 대부분의 N 맨끝을 포함 하는 누적된 HTT 조각 구성 확대 polyQ, 그 베이스를 나타내는 전장 HTT의 대안 접합^8,처리⁹ 할 수는 HD. N-터미널 HTT 파편의 병 인에 중요 한 역할 수 빠르게 집계, nucleate, 고 가속 또는 집계 프로세스¹⁰전파 HTT의 pathologic 형태를 구성 수 있습니다.

그러나, 이러한 포함의 존재 HTT 유발 독성 또는 세포 죽음¹¹와 반드시 연결 되지 않습니다. HTT 불용 성 집계를 포함¹²성 oligomeric 종 및 β-시트 소 통해 녹는 단위체에서 집계 과정을 제안 하고있다. 이러한 다양 한 단백질 종 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 통해 해결 낮은 세제 세포의 용 해 버퍼에서 그들의 안정성과 표준 생 화 확 적인 분석 실험을 사용 하 여 시각화에 어려움으로 인해 필드에 도전이 되었습니다. 따라서, 방법론 고려 사항 학위 및 누적 및 집계 mHTT의 패턴 감지에 중요 하다.

여기에 제시 된 프로토콜 제공 HTT, 특히 HD pathogenesis 및 질병 진행^{1,13 와 밀접 하 게 추적에 표시 되는 불용 성 HMW HTT 종 형성의 여러 중간체를 시각화 하는 방법 14}. 해결 하 고 추적 mHTT의 여러 종 수 연구원은 질병 병 인을 연구 하 고 그들의 변조 및 질병 병 인에 미치는 영향을 통해 잠재적인 치료 내정간섭을 평가 생화학 도구를 제공 합니다.

Protocol

동물 윤리 문-실험 실시 했다 관심과 건강의 국가 학회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (에 의해 승인 된 동물 연구 프로토콜의 사용의 실험실 동물에 대 한 가이드와 함께 따라 IACUC), 어바인가 주 대학에는 AAALAC 공인 기관. 모든 노력 동물 고통 최소화 되었다. 1입니다. 세포의 용 해 버퍼의 준비 세포의 용 해 버퍼 “수용 성” 준비 (10 mM Tris pH 7.4, 1% 트리톤 X 100, 150 mM NaC…

Representative Results

분류에 따라 가용성과 불용 성 세포 lysates의 해상도 서양 분석 및 필터 지체 분석 (그림 2)를 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 예를 들어, HEK293T 세포 transfection 시 약 (예를 들어, lipofectamine 2000)를 사용 하 여 페 했다, HTT exon과 97 글루타민을 포함의 인코딩 cDNA 1 개15 폴 리 프롤린 풍부한 지역 이어서 반복 하 고 이러한 셀 수 있었…

Discussion

일관 되 고 양적 결과 보장 하기 위해 위의 프로토콜에 대 한 몇 가지 예방 조치 필요 합니다. 첫째, 두 분수에서 mHTT 저절로 형성 집계 여러 동결 해 동 주기, 시 시간이 지남에 특히 높은 농도에. 그것은 따라서 단백질 preps의 aliquots 고정만 위의 프로토콜에 설명 된 대로 시험을 실행 하기 전에 필요한 볼륨을 해 동 하는 중요 한. 또한, 불용 성 분수 녹고 시 흰색 비례적 수율, 경우 재구성 추가 5 s ?…

Materials

Sterile Filter	Millipore	SCGP505RE	Screw cap, sterile vaccum filter
1 mL Tissue Grinder, Dounce	Wheaton	357538
Sonicator	Qsonica	Model Q125
DC Protein Assay	Biorad	5000111	Comparable to Lowry assay
Tris 1M buffer solution	Alfa Aesar	J60636
Triton X-100	Fisher	BP151-100
NaCl 5M solution	Teknova	S0251
Glycerol	Fisher	BP229-1
20% SDS solution	Teknova	S0295
N-ethylmaleimide	Sigma	E1271
Phenylmethylsulfony flouride	Sigma	P7626	create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C
Sodium orthovanadate	Sigma	S6508	Create 0.5M stock solution in water
Leupeptin	Sigma	L2884	Create 10mg/ml stock solution in water
Aprotinin	Sigma	A1153	Create 10mg/ml stock solution in water
Sodium Fluoride	Sigma	S4504	Create 500mM stock solution in water
Anti-HTT	Millipore	MAB5492	Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay
Anti-GAPDH	Novus Biologicals	NB100-56875	Use 1:1000 for soluble western blot