En metode er beskrevet fraksjoneres uløselig og løselig mutant huntingtin arter fra musen hjernen og celle kultur. Metoden beskrevet er nyttig for karakterisering og måling av huntingtin protein flux og hjelpemidler i å analysere protein homeostase i patogenesen ved sykdom og i nærvær av forstyrrelser
Oppsamling av misfolded proteiner er sentralt for patologi i Huntingtons sykdom (HD) og mange andre nevrodegenerative lidelser. Spesielt en patologisk nøkkelfunksjon i HD er avvikende opphopning av mutant HTT (mHTT) protein i høy molekylvekt komplekser og intracellulær inkludering organer består av fragmenter og andre proteiner. Konvensjonelle metoder for å måle og forstå bidrag av ulike former for mHTT inneholder aggregater inkluderer fluorescens mikroskopi, western blot analyse og filter felle analyser.
Men de fleste av disse metodene er konformasjon bestemt, og derfor kan ikke løse hele delstaten mHTT protein forandring på grunn av den komplekse naturen samlet løselighet og oppløsning.
For identifisering av oppsamlet mHTT og ulike endret former og komplekser er separasjon og solubilization av mobilnettet aggregater og fragmenter obligatorisk. Vi beskriver her en metode for å isolere og visualisere løselig mHTT, monomerer, oligomers, fragmenter, og en uløselig høy molekylvekt (HMW) akkumulert mHTT arter. HMW mHTT spor med sykdomsprogresjon, samsvarer med mus atferd readouts, og har vært beneficially modulert av visse terapeutisk intervensjon1. Denne tilnærmingen kan brukes med musen hjernen, perifere vev og cellekultur, men kan tilpasses andre modellsystemer eller sykdom sammenhenger.
Avbrudd i protein kvalitetskontroll nettverk som sikrer riktig folding og nedbrytning av mobilnettet proteiner er sannsynlig sentralt patologi i Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), og andre “protein misfolding” lidelser2,3. En detaljert forståelse av proteostasis nettverkskomponentene og deres bidrag til patologi er derfor avgjørende å utvikler forbedret terapeutisk intervensjon. HD skyldes unormal utvidelse av en CAG gjentakelse i HD genet som resulterer i en utvidet strekning av polyglutamines (polyQ) i huntingtin (HTT) protein4. En konsekvent patologisk funksjon i HD patogenesen er den resulterende misfolding, akkumulering og samling av HTT i områder av hjernen og i perifere vev, som har blitt vist å påvirke på måter normal celle homeostase og funksjon 5 , 6. mens HTT uttrykkes overalt, middels spiny nerveceller i striatum er selektivt sårbare og mest åpenlyst berørte med kjente kortikale atrofi også forbundet med HD patogenesen.
Dannelsen av aggregater av HTT i hjernen av HD pasienter og dyremodeller har vanligvis servert som en proxy markør for sykdomsprogresjon og dominerende-negative gevinst for funksjon for mHTT7. Selv om nøyaktige mekanismer som protein misfolding og aggregering kan bidra til mHTT-indusert toksisitet forblir uklart, er dannelsen av slike Inneslutninger i hjernen av HD pasienter og ulike dyr modeller en konstant og uunngåelig funksjon. Inneslutninger vises skal består hovedsakelig av akkumulert HTT fragmenter som inneholder N-terminalen utvidet polyQ, som indikerer at proteolyse og behandling av full lengde HTT samt alternativ skjøting8,9 kan spille en viktig rolle i patogenesen av HD. N-terminal HTT kan utgjøre en patologisk form for HTT som kan raskt, nucleate, og akselerere overføre samling prosessen10.
Men samsvarer tilstedeværelsen av slike Inneslutninger ikke nødvendigvis med HTT-indusert toksisitet eller celle død11. HTT har blitt foreslått å gjennomgå en samling prosessen fra en løselig monomer gjennom løselig oligomeric arter og β arks fibrils til uløselig aggregater og Inneslutninger12. Løse disse ulike protein arter via standard biokjemiske analyser har vært en utfordring innen deres stabilitet i lav-rengjøringsmiddel lyseringsbuffer og vanskeligheter med å visualisere bruker standard biokjemiske analyser. Dermed er metodologiske avgjørende i å oppdage den grad og mønster av akkumulert og samlet mHTT.
Protokollen presenteres her gir en metode for å visualisere flere intermediates av HTT, spesielt dannelsen av en uløselig HMW HTT Art til nøye spore med HD patogenesen og sykdom progresjon1,13 ,14. Å løse og spore flere arter av mHTT gir forskere et biokjemiske verktøy å studere sykdom patogenesen og vurdere potensielle terapeutiske tiltak gjennom modulering og innvirkning på sykdom patogenesen.
Forholdsregler er nødvendig for over-protokoller for å sikre konsekvent og kvantitative resultater. Først mHTT i både fraksjoner vil spontant danne aggregater over tid ved flere fryse tine sykluser, spesielt når du er i en høy konsentrasjon. Det er dermed viktig fryse dele protein forutbetalt, og tine bare nødvendig volumet før du kjører analysen som beskrevet i protokollen ovenfor. Videre, hvis uløselig brøkdel gir hvit precipitant ved tining, rekonstituering kan være nødvendig ved et ytterligere 5 s sonica…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH (RO1-NS090390). Vi vil også gjerne takke Dr. Joan Steffanfor teknisk assistanse og diskusjon under utviklingen av denne analysen.
Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |