Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma
Summary
Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için yararlıdır
Abstract
Misfolded proteinleri birikimi patoloji Huntington hastalığı (HD) ve diğer birçok nörodejeneratif hastalıklar için merkezi bir noktada bulunuyor. Özellikle, bir ana patolojik HD yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri içine mutant HTT (mHTT) protein birikimine anormal özelliğidir ve hücre içi dahil ceset parçaları ve diğer proteinler oluşur. Ölçmek ve mHTT içeren toplamları çeşitli formları katkılarıyla Floresans mikroskobu, western blot analizi ve filtre dahil anlamak için geleneksel yöntemler deneyleri tuzak.
Ancak, bu yöntemlerin çoğu belirli biçimi vardır ve bu nedenle mHTT protein akı toplama çözünürlük ve çözünürlük karmaşık yapısı nedeniyle tam durumunu çözmeyebilir.
Toplanan mHTT ve çeşitli değiştirilmiş form ve kompleksleri kimlik için ayırma ve solubilization hücresel toplamları ve parçaları zorunlu değildir. Burada biz yalıtmak ve görselleştirmek çözünür mHTT, monomerleri, reaksiyonlar, parçaları için bir yöntem tanımlamak ve çözünmez yüksek molekül ağırlıklı (HMW) mHTT türler birikmiş. HMW mHTT izler hastalık ilerlemesi ile fare davranışı çıktıları ile karşılık gelir ve beneficially belirli tedavi müdahaleler1tarafından modüle. Bu yaklaşım fare beyni, periferik doku ve hücre kültürü ile kullanılabilir ancak diğer sistemleri modellemek bağlamı olarak da bilinen hastalık için adapte edilebilir.
Introduction
Uygun katlama sağlamak protein kalite kontrol ağları bozulma ve yıkımı proteinlerin patoloji Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) için büyük olasılıkla orta ve protein diğer “misfolding” olduğunu 2,3bozuklukları. Proteostasis ağ bileşenleri ve onların katkıları patoloji için detaylı bir anlayış bu nedenle geliştirilmiş tedavi müdahaleler geliştirmek için çok önemli. HD bir CAG tekrar polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) protein4genişletilmiş bir streç sonuçlanan HD gen içinde anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. Bir tutarlı patolojik HD Patogenez elde edilen misfolding, birikimi ve çeşitli şekillerde normal hücre homeostazı ve işlev girişimine gösterilen HTT beyin bölgelerinde ve periferik dokularda agregasyon özelliğidir 5 , 6. iken HTT ubiquitously ifade, striatum orta dikenli nöronların Ayrıca HD patogenezi ile ilgili dikkate değer kortikal Atrofi ile seçmeli olarak savunmasız ve en açıktan etkilenen vardır.
HTT HD hasta ve hayvan modelleri beyinde agrega oluşumu genellikle hastalık ilerleme ve baskın negatif kazanç mHTT7için işlevinin bir proxy marker olarak hizmet vermiştir. Hangi protein tarafından misfolding ve toplama mHTT kaynaklı toksisite için katkıda bulunabilir kesin mekanizmaları belirsiz kalır rağmen beyindeki bu kapanımlar HD hasta ve çeşitli hayvan modelleri oluşumu bir sabit ve kaçınılmaz özelliğidir. N-terminal içeren büyük ölçüde birikmiş HTT parçaları oluşan için o proteolizis belirten polyQ, genişletilmiş ve tam uzunlukta HTT yanı sıra alternatif Uçbirleştirme8,işleme9 oynayabilir kapanımlar görünür bir HD. N-terminal HTT parçaları patogenezinde önemli rol hızla toplamak, nucleate ve hızlandırmak veya toplama işlemi10yaymak HTT patolojik bir tür teşkil edebilir.
Ancak, bu eklemeler varlığı mutlaka HTT kaynaklı toksisite ya da hücre ölüm11ile ilişkilendirmek değil. HTT çözünür bir monomer çözünür oligomeric türler ve β-yapraklık liflerinde bir toplama işleminden çözünmez toplamları ve kapanımlar12geçmesi teklif edildi. Bu protein türleri standart biyokimyasal deneyleri ile çözme onların istikrar içinde düşük-deterjan lizis tampon ve standart biyokimyasal testleri kullanarak görselleştirme zorluk nedeniyle alandaki bir mücadele vardı. Böylece, metodolojik konusu derecesi ve birikmiş ve toplanan mHTT desen saptamada kritik önem taşır.
Burada sunulan Protokolü HTT, özellikle HD Patogenez ve hastalık ilerleme1,13 ile yakından izlemek için görünür bir çözünmez HMW HTT türlerin oluşumu, birkaç ara ürün görselleştirmek için bir yöntem sağlar ,14. Gidermek ve mHTT birden çok tür takip edememek araştırmacılar hastalığın patogenezinde çalışma ve modülasyon ve hastalık patogenezinde üzerindeki etkisi ile potansiyel terapötik müdahaleler değerlendirmek biyokimyasal bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bazı önlemler tutarlı ve kantitatif sonuç sağlamak yukarıdaki iletişim kuralları için ihtiyaç vardır. İlk olarak, mHTT her iki kesirler kendiliğinden toplamları üzerine birden çok donma çözülme çevrimleri, zamanla oluşturacak özellikle ne zaman yüksek bir konsantrasyon içinde. Böylece protein preps aliquots dondurma ve yalnızca gerekli birim Protokolü yukarıda açıklandığı gibi tahlil çalıştırmadan önce çözülme çok önemlidir. Ayrıca, çözünmez kesir çözdürme üzerine beyaz …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH (RO1-NS090390) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. Joan Steffanfor teknik yardım ve tartışma bu tahlil geliştirilmesi sırasında teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
References
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
