Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes
Summary
El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células fijas
Abstract
El citoesqueleto, compuesto de microfilamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios (IF), desempeña un papel clave en el control de la forma celular, la polaridad y la motilidad. La organización de las redes de actina y microtúbulos ha sido extensamente estudiada pero de IFs no es todavía completamente caracterizado. IFs tiene un diámetro promedio de 10 nm y forma una red que se extiende por todo el citoplasma de la célula. Se asocian físicamente con actina y microtúbulos a través de motores moleculares y linkers del citoesqueleto. Esta asociación estrecha está en el corazón de los mecanismos de regulación que garanticen la regulación coordinada de las tres redes citoesqueléticas necesarios para la mayoría de las funciones de la célula. Por lo tanto, es fundamental visualizar IFs solas y también conjuntamente con cada una de las otras redes citoesqueléticas. Sin embargo, las redes de IF son extremadamente densas en más tipos de células, especialmente en células gliales, que hace que su resolución sea muy difícil de conseguir con microscopía de fluorescencia estándar (lateral resolución de ~ 250 nm). Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es una técnica que permite un aumento en la resolución lateral de un orden de magnitud. Aquí, mostramos que resolución dSTORM lateral es suficiente para resolver la organización densa de las redes de IF y, en particular, de los paquetes de IF que rodea a los microtúbulos. Asociación tan apretado es probable que participan en la regulación coordinada de estas dos redes y mayo, explicar cómo plantilla de IFs vimentin y estabilizar la organización microtubular como podría influir en tráfico vesicular dependiente de microtúbulos. Más en general, nos muestran cómo la observación de dos componentes citoesqueléticos con técnica de doble color dSTORM trae nuevas perspectivas en su mutua interacción.
Introduction
Filamentos intermedios citoplasmáticos (IFs) son 10 nm de diámetro homo – o heteropolymers de un subconjunto específico de tipo de célula de las proteínas de los IF. IFs participan en una amplia gama de funciones celulares tales como respuestas de motilidad, proliferación y estrés celular. Su papel fundamental se destaca por el hecho de que más de 90 enfermedades humanas son causadas directamente por las mutaciones en las proteínas de la IF; por ejemplo, cambios en la composición de IF acompaña a crecimiento del tumor y propagación1,2,3. Existe una creciente evidencia de que los tres sistemas de citoesqueleto trabajan en colaboración para el control de las funciones celulares tales como polarización celular, división y migración2,3. Puesto que hay un acoplamiento apretado entre la arquitectura espacial y funciones, es crucial obtener ideas sobre la organización estructural de la IF con los otros filamentos y comprender mejor la diafonía citoesqueleto. Este artículo proporciona un protocolo para llevar a cabo la resolución súper técnica doble color dSTORM (directo estocástico reconstrucción microscopía óptica)4 y cómo se utiliza para investigar la interacción entre si y microtúbulos en fijo, cultivadas células en 2 dimensiones (2D).
Varias técnicas de superresolución se han desarrollado durante el pasado decenio y descubrimientos allí estaban en el origen del Premio Nobel de química en 20145. Entre todas estas técnicas se encuentra los molécula única localización métodos como PALM6 (microscopía de localización Photo-Activated) que utiliza proteínas fluorescentes fotoconmutables, tormenta7 con pares de fluoróforos o dSTORM4 con fluoróforos convencional. Todos estos métodos se basan en el mismo principio que consiste en (i) el interruptor de la mayoría de los reporteros fluorescentes en un estado de “off” “la estado de (no fluorescente), (ii) la activación estocástica de un subconjunto de ellos en un fluorescente para localizar su posición espacial con precisión de nanómetros y (iii) la repetición de este proceso para activar tantos subconjuntos de fluoróforos como sea posible. Una imagen final es reconstruida usando todas las localizaciones de las moléculas activadas, proporcionando una resolución lateral de ~ 20-40 nm. Varios sistemas ópticos comercializados que tormenta de Palma ya están disponibles para los biólogos para experimentos de la rutina. Aquí, un sistema de este tipo fue utilizado para el estudio de la Asociación estructural de los microtúbulos e IFs. Entre todos los sola molécula basada en la localización de métodos, la técnica de doble color dSTORM fue seleccionada, porque es idóneo para observar las regiones laminares muy finas (< 1 μm) de células adherentes y pueden proporcionar una mejoría significativa de la resolución de la imagen con inversión mínima de tiempo y dinero. De hecho, dSTORM es una técnica muy conveniente y versátil que es compatible con el estándar colorantes orgánicos habitualmente utilizados para la tinción celular e inmunofluorescencia.
Mientras que un color dSTORM imágenes son relativamente fáciles de obtener con el fluoróforo Alexa6478, color doble dSTORM requiere para optimizar las condiciones experimentales para que dos tintes pueden parpadear correctamente en el buffer elegido, especialmente cuando hay limitada energía del laser. Excelentes artículos ya están disponibles en los métodos para crear imágenes de múltiples colores con dSTORM9,10,11,12,13, y estos documentos explican detalladamente las posibles fuentes de artefactos y la resolución de la imagen degradada y cómo superarlos. En este artículo, las condiciones experimentales óptimas en términos de fijación de las células, immunostaining, preparación de muestras, adquisición de imágenes y reconstrucción de la imagen se describen para adquirir imágenes de densas redes de IF citoplásmicas y microtúbulos en células gliales con doble color dSTORM. Brevemente, el método de extracción/fijación descrito en Chazeau et al12 fue adaptado a las células gliales y utilizado con un paso de la fijación, concentración de anticuerpos optimizado, un búfer de tormenta con 10 mM MEA descrito en9 de Dempsey et al. que fue encontrado para ser óptimo para el montaje experimental y el tipo de muestra.
Células gliales expresan principalmente tres tipos de proteínas de los IF: vimentina, nestina y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Estas tres proteínas mostraron Co polimerizarse en astrocitos14. Previamente demostramos mediante microscopía de iluminación súper resolución estructurada (SR SIM) que estas tres proteínas IF pueden encontrarse en el mismo filamento único de IF y que muestran similar dinámica y distribución en las células gliales 15. Debido a las similitudes entre las tres proteínas de IF, vimentin tinción fue utilizado como reportero para la red IF. Con dSTORM, hemos logrado resolver cómo haces de forma IF a lo largo de los microtúbulos, que no era posible con la difracción limitada de técnicas de microscopía15. Estas observaciones pueden ayudar a entender cómo vimentin IFs pueden microtúbulos de plantilla y regular la trayectoria de crecimiento, promoviendo el mantenimiento de un eje de polaridad durante la migración de la célula16. Imágenes de súper-resolución proporcionaron información clave en la interacción mutua de los dos subsistemas de citoesqueleto y trajeron la visión de la relación entre Asociación espacial y función local que podría ser el tipo de célula específica17. En general, dSTORM dos colores puede utilizarse para el estudio de la diafonía entre elementos citoesqueléticos u otros tipos de organelos, que immunostaining buenas condiciones se alcanzan en términos de densidad y especificidad. Esta técnica será útil para caracterizar mejor a los cambios del citoesqueleto observados astrogliosis y glioblastoma, el tumor más frecuente y más maligno del sistema nervioso central, donde la expresión de proteínas de IF es alterado 18 ,19,20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Aquí presentamos un protocolo que reduce al mínimo los artefactos en las imágenes dSTORM de los microtúbulos e IFs en células gliales. Cada paso de la preparación de la muestra y proyección de imagen pueden crear artefactos: fijación, bloqueo, inmunomarcación, a la deriva durante la adquisición, no óptima intermitente condiciones23. Enumeramos a continuación los pasos más críticos.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mickael Lelek, Orestis Faklaris Nicolas Bourg para la discusión fructífera, Andrey Aristov y Elena Rensen para ayuda con la técnica de súper-resolución y Shailaja Seetharaman para la cuidadosa lectura del manuscrito. Agradecemos Citech UtechS Bioimagen fotónica (Imagopole) del Instituto Pasteur (París, Francia), así como la red de infraestructuras de Bioimagen Francia apoyada por la agencia francesa de investigación nacional (ANR-10-INSB-04; Inversiones para el futuro) y la Région Ile (programa Domaine d’Intérêt mayor-Malinf) para el uso del microscopio Elyra. Este trabajo fue financiado por el el Ligue Contre le cáncer y la agencia francesa de investigación nacional (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
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