Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Summary

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste cellen

Abstract

Het cytoskelet, samengesteld uit actine Microfilamenten, microtubuli, en intermediaire filamenten (IF), speelt een sleutelrol in de controle van de cel vorm, polariteit en beweeglijkheid. De organisatie van de netwerken actine en microtubulus heeft uitvoerig bestudeerd maar die van IFs is niet nog volledig gekenmerkt. IFs heeft een gemiddelde diameter van 10 nm en vorm een netwerk uit te breiden in het cytoplasma van de cel. Ze zijn fysiek geassocieerd met actine en microtubuli door moleculaire motoren en cytoskeletal linkers. Deze strakke vereniging is de kern van de regelgevende mechanismen die de gecoördineerde regeling van de drie cytoskeletal netten die nodig zijn voor de meeste functies van de cel. Het is daarom belangrijk om te visualiseren IFs alleen en ook samen met elk van de andere cytoskeletal netwerken. Echter, als netwerken zijn zeer dicht in de meeste soorten cellen, met name in gliacellen, waardoor zijn resolutie zeer moeilijk te bereiken met standaard fluorescentie microscopie (lateraal resolutie van ~ 250 nm). Directe stochastische optische wederopbouw microscopie (dSTORM) is een techniek waardoor een winst in laterale resolutie van een orde van grootte. Hier, laten we dat laterale dSTORM resolutie voldoende is voor het oplossen van de dichte organisatie van de IF-netwerken en, in het bijzonder als bundels omringende microtubuli. Deze strakke vereniging dreigt te deelnemen aan de gecoördineerde verordening van deze twee netwerken en mei, uitleggen hoe vimentin IFs sjabloon en organisatie van de microtubuli stabiliseren alsmede microtubulus afhankelijke vesiculaire handel kunnen beïnvloeden. Meer in het algemeen, laten we zien hoe de observatie van twee cytoskeletal componenten met dual-kleur dSTORM techniek brengt nieuw inzicht in hun wederzijdse interactie.

Introduction

Cytoplasmatische Intermediaire filamenten (IFs) zijn 10 nm diameter homo- of heteropolymers van een cel type specifieke deelverzameling van als eiwitten. IFs deelnemen aan een groot aantal cellulaire functies zoals cel proliferatie, beweeglijkheid en stress reacties. Hun belangrijke rol wordt benadrukt door het feit dat meer dan 90 ziekten bij de mens direct door mutaties in als eiwitten veroorzaakt worden; bijvoorbeeld, veranderingen in samenstelling als begeleidt groei van de tumor en de verspreiding van^1,2,3. Er is steeds meer aanwijzingen dat de drie systemen van het cytoskelet in samenwerking tot controle cellulaire functies zoals cel polarisatie, divisie en migratie^{2,3 werken}. Aangezien er een nauwe koppeling tussen ruimtelijke architectuur en functies, is het van cruciaal belang zijn om inzicht in de structurele organisatie of als met de andere draden en de cytoskeletal cross-talk beter te begrijpen. Dit artikel bevat een protocol voor het uitvoeren van de super resolutie techniek dual-kleur dSTORM (directe stochastische optische wederopbouw microscopie)⁴ en hoe het wordt gebruikt voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen als en microtubuli in vaste, gekweekt cellen in 2 dimensies (2D).

Verschillende super resolutie technieken zijn ontwikkeld de afgelopen tien jaar, en er ontdekkingen waren op de oorsprong van de Nobelprijs voor de Scheikunde in 2014⁵. Onder al deze technieken ligt de enkel molecuul lokalisatie gebaseerde methoden zoals PALM⁶ (Photo-Activated lokalisatie microscopie) die gebruik maakt van photoswitchable fluorescente proteïnen, STORM⁷ met paren van fluorophores of dSTORM⁴ met conventionele fluorophores. Al deze methoden zijn gebaseerd op hetzelfde principe dat uit (i) de switch van de meeste van de fluorescerende verslaggevers in een “off” staat bestaat”(niet-tl), (ii) de stochastische activering van een subset van hen in een TL staat te lokaliseren hun ruimtelijke positie met nanometer nauwkeurigheid, en (iii) de herhaling van dit proces om te activeren zoveel deelverzamelingen van fluorophores mogelijk. Een uiteindelijke afbeelding wordt gereconstrueerd met behulp van alle taalversies van de geactiveerde moleculen, die een laterale resolutie tot ~ 20-40 nm. Verschillende gecommercialiseerd optische systemen waardoor PALM/STORM zijn nu beschikbaar voor biologen voor routinematige experimenten. Hier, werd een dergelijk systeem gebruikt om de structurele studievereniging van microtubuli en IFs. Onder alle single-molecuul lokalisatie gebaseerde methoden, de techniek dual-kleur dSTORM werd geselecteerd, want het is zeer geschikt voor het observeren van zeer dunne lamellaire gebieden (< 1 µm) van Adherente cellen en kan zorgen voor aanzienlijke verbetering van de resolutie van de afbeelding met minimale investering van tijd en geld. DSTORM is inderdaad een zeer handige en veelzijdige techniek die compatibel is met de standaard organische kleurstoffen routinematig gebruikt voor cellulaire kleuring en immunofluorescentie.

Terwijl één dSTORM kleurenafbeeldingen relatief eenvoudig zijn te verkrijgen met behulp van de fluorophore Alexa647⁸, vereist dubbele kleur dSTORM voor het optimaliseren van de experimentele omstandigheden, zodat de twee kleurstoffen kunnen goed knipperen in de gekozen buffer, vooral wanneer er beperkte Laser macht. Uitstekende papieren zijn reeds beschikbaar op de methoden instellen Multi-Color beeldbewerking met dSTORM^{9,10,11,12,13}, en deze documenten uitleggen in detail de mogelijke bronnen van artefacten en aangetaste beeldresolutie en instructies om ze te overwinnen. In dit artikel, de optimale proefomstandigheden in termen van fixatie van de cellen, immunokleuring, bereiding van de monsters zijn imaging verwerving en afbeelding wederopbouw beschreven om het verwerven van beelden van dichte cytoplasmatische als netwerken en microtubuli in gliacellen met dual-kleur dSTORM. Kort, de in Chazeau et al.¹² beschreven methode van extractie/fixatie werd aangepast aan gliale cellen en gebruikt met een na fixatie stap, geoptimaliseerde antilichamen concentratie, een STORM buffer met 10 mM MEA beschreven in Dempsey⁹ et al. dat was blijken te zijn optimaal voor de experimentele instellen en het type van de steekproef.

Gliacellen express hoofdzakelijk drie soorten als eiwitten: vimentin, nestin en GFAP (gliale zure fibrillary eiwit). Deze drie eiwitten is gebleken dat waren mede polymeriseren in astrocyten¹⁴. Eerder toonden wij met behulp van super resolutie gestructureerd verlichting microscopie (SR SIM) dat deze drie als eiwitten kunnen worden gevonden in de dezelfde interne als gloeidraad en dat zij soortgelijke verdeling en dynamiek in gliacellen ¹⁵weergegeven. Als gevolg van de overeenkomsten tussen de drie als eiwitten, werd vimentin kleuring gebruikt als een verslaggever voor het hele netwerk als. Met behulp van dSTORM, kunnen we oplossen hoe beperkt als formulier bundels langs microtubuli, die was niet mogelijk met diffractie microscopie technieken¹⁵. Deze opmerkingen kunnen helpen te begrijpen hoe vimentin IFs kunnen sjabloon microtubuli en reguleren van hun groei traject, bevordering van het behoud van een polariteit as tijdens cel migratie¹⁶. Super resolutiebeelden belangrijke informatie verstrekt over de wederzijdse interactie van de twee cytoskeletal subsystemen en inzicht in de koppeling tussen ruimtelijke vereniging en lokale functie die celtype specifieke¹⁷zou kunnen worden gebracht. In het algemeen, kan dual-kleur dSTORM worden gebruikt om te studeren de Overspraak tussen cytoskeletal elementen of andere soorten organellen, mits goede immunokleuring voorwaarden zijn bereikt in termen van dichtheid en specificiteit. Deze techniek nuttig zal zijn voor beter karakteriseren het cytoskelet wijzigingen waargenomen tijdens astrogliosis en in glioblastoma, de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel, waar de uitdrukking van als eiwitten is gewijzigd ^{18 ,19,20,21}.

Protocol

1. Coverslips voorbereiding (dag 1, 30 min) De 18-mm nº1.5H (170 µm +/-5µm) glazen coverslips op een kunststof rek plaatsen. Zet het rek in een bekerglas van 100 mL gevuld met aceton en weken voor 5 min. Het rek overbrengen in een bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en weken voor 5 min. Het rek overbrengen naar een nieuw bekerglas van 100 mL gevuld met absolute ethanol en plaats het bekerglas in een ultrasone reiniger apparaat (zie tabel van materialen) bij kamertem…

Representative Results

Een microscoop voorzien van 50 mW 405 nm en 100 mW 488, 561 en 642 nm solid-state lasers, een EMCCD van 512 x 512 camera, een alpha Plan Apo 100 X / 1,46 objectieve en Band Pass 570-650 / lange Pass 655 emissie filters werd gebruikt voor de representatieve resultaten hieronder gepresenteerd. Figuur 1A geeft een voorbeeld van het molecuul dichtheid en signaal / ruisverhouding dat tijdens raw image aq…

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Wij presenteren hier een protocol die artefacten in de dSTORM beelden van microtubuli en IFs in gliacellen minimaliseert. Artefacten kunnen worden gecreëerd bij elke stap van de bereiding van de monsters en de beeldvorming: fixatie, blokkeren, immunolabeling, drift tijdens overname, niet-optimale knipperende voorwaarden²³. We geven hieronder de belangrijkste stappen.

Schoonmaken van de cover…

Materials

Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2