Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

Summary

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die optimalen Versuchsbedingungen von Probenvorbereitung zur Bildaufnahme und zum Wiederaufbau zu geben, um 2D dual dSTORM Farbbilder von Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente in festen Zellen durchführen

Abstract

Das Zellskelett, bestehend aus Aktin beschäftigt, Mikrotubuli und fortgeschrittene Filamente (IF), spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Polarität und Motilität. Die Organisation der Aktin und Mikrotubuli Netzwerke wurde ausgiebig studiert, aber der IFs ist noch nicht vollständig charakterisiert. IFs haben einen Durchmesser von 10 nm und bilden ein Netzwerk erweitern in der gesamten Zelle Zytoplasma. Sie sind physisch verbunden mit Aktin und Mikrotubuli durch molekulare Motoren und Zytoskeletts linker. Diese enge Verbindung ist das Herzstück der Regulationsmechanismen, die für die koordinierte Regulierung der drei Zellskelett Netze erforderlich für die meisten Zellfunktionen sorgen. Es ist daher entscheidend für IFs allein und auch gemeinsam mit den jeweiligen anderen Zellskelett Netzwerke zu visualisieren. IF-Netzwerke sind jedoch extrem dicht in den meisten Zelltypen, vor allem in Gliazellen, wodurch seine Auflösung sehr schwer zu erreichen mit standard Fluoreszenz-Mikroskopie (laterale Auflösung von ~ 250 nm). Direkte stochastische Wiederaufbau Lichtmikroskopie (dSTORM) ist eine Technik, so dass einen Gewinn in lateraler Auflösung um eine Größenordnung. Hier zeigen wir, dass seitliche dSTORM Auflösung ausreichend, um die dichten Organisation der IF Netze und vor allem IF-Bundles rund um Mikrotubuli zu beheben ist. Solche engen Assoziation wird voraussichtlich in der koordinierten Verordnung dieser zwei Netzwerke und Mai teilnehmen, erklären wie Vimentin IFs Vorlage und stabilisieren Mikrotubuli Organisation sowie Mikrotubuli abhängigen vesikuläre Menschenhandel beeinflussen könnten. Ganz allgemein zeigen wir, wie die Beobachtung des Zytoskeletts Zweikomponenten mit zweifarbige dSTORM Technik bringt neue Einblicke in ihren Wechselwirkungen.

Introduction

Zytoplasmatischen intermediate Filamente (IFs) sind 10 nm Durchmesser Homo- oder Heteropolymers einer Zelle Art spezifische Teilmenge von IF-Proteine. IFs Teilnahme an einer Vielzahl von zellulären Funktionen wie Zell-Motilität, Verbreitung und Stress-Reaktionen. Ihre wichtige Rolle wird durch die Tatsache hervorgehoben, die mehr als 90 Krankheiten beim Menschen direkt durch Mutationen im IF-Proteine verursacht werden; zum Beispiel Veränderungen in der Zusammensetzung der IF begleitet Tumorwachstum und Ausbreitung^1,2,3. Es wächst Beweise, die die drei Zytoskelett-Systeme zusammen, um zelluläre Funktionen wie Zelle Polarisation, Teilung und Migration^{2,3 arbeiten}. Da gibt es eine enge Kopplung zwischen Raumarchitektur und Funktionen, ist es entscheidend, erhalten Einblicke in die strukturelle Organisation des IF mit den anderen Filamenten und ein besseres Verständnis des Zytoskeletts Übersprechen. Dieser Artikel enthält ein Protokoll zur Durchführung der Super-Resolution Technik zweifarbige dSTORM (direkte stochastische optische Rekonstruktion Microscopy)⁴ und wie es verwendet wird, um die Interaktion zwischen wenn zu untersuchen und Mikrotubuli in feste, kultiviert Zellen in 2 Dimensionen (2D).

Mehrere Super-Resolution-Techniken wurden in den vergangenen zehn Jahren und es gibt Entdeckungen wurden am Ursprung der Nobelpreis für Chemie im Jahr 2014⁵. Unter all diesen Techniken liegt die Einzelmolekül Lokalisierung-basierte Methoden wie PALM⁶ (Photo-Activated Localization Microscopy) die photoschaltbare fluoreszierende Proteine verwendet STORM⁷ mit paar Fluorophore oder dSTORM⁴ mit konventionellen Fluorophore. Alle diese Methoden basieren auf dem gleichen Prinzip besteht aus (i) den Schalter für den Großteil der fluoreszierenden Reporter in einem “off” Zustand”(nicht-fluoreszierende), (Ii) die stochastische Aktivierung einer Teilmenge davon in einem fluoreszierenden Zustand um lokalisieren ihre räumliche Lage mit Nanometer-Genauigkeit und (Iii) die Wiederholung dieses Prozesses um so viele Teilmengen des Fluorophore wie möglich zu aktivieren. Eine endgültige Bild wird rekonstruiert, mit alle Lokalisierungen der aktivierten Moleküle, bietet einen lateralen Auflösung bis zu ~ 20-40 nm. Mehrere kommerzialisierten optische Systeme, so dass PALM/Sturm stehen jetzt für Biologen für routinemäßige Experimente. Hier wurde ein solches System verwendet, um die strukturellen Vereinigung von Mikrotubuli und IFs zu studieren. Unter all den Einzelmolekül-Lokalisierung-basierte Methoden, die zweifarbige dSTORM Technik wurde ausgewählt, weil es gut geeignet, um sehr dünne lamellare Bereiche zu beobachten ist (< 1 µm) von adhärenten Zellen und bieten signifikante Verbesserung der Bildauflösung mit minimale Investition von Zeit und Geld. DSTORM ist in der Tat eine sehr bequeme und vielseitige Technik, die kompatibel mit den standard organischen Farbstoffen zum zellulären Beizen und Immunfluoreszenz routinemäßig eingesetzt.

Während einer Farbe dSTORM Bilder relativ einfach sind zu erhalten, mit dem Fluorophor Alexa647⁸, erfordert doppelte Farbe dSTORM die Versuchsbedingungen so optimieren, dass zwei Farbstoffen richtig im gewählten Puffer blinken können, vor allem, wenn es begrenzt ist Laserleistung. Ausgezeichnete Papiere sind bereits auf die Methoden zum Einrichten von Multi-Color-Bildgebung mit dSTORM^{9,10,11,12,13}, und diese Papiere im Detail erklären, die möglichen Fehlerquellen Artefakte und degradierten Bildauflösung sowie zu deren Überwindung. In diesem Artikel, der optimalen experimentellen Bedingungen in Bezug auf Zellen Fixierung, Immunostaining, Probenvorbereitung sind bildgebende Erwerb und Bildrekonstruktion beschrieben um Bilder von dichten zytoplasmatischen IF Netze und Mikrotubuli in erlangen Gliazellen mit zweifarbige dSTORM. Kurz, die Extraktion/Fixierung in Chazeau Et Al¹² beschriebene Methode wurde an Gliazellen angepasst und mit einem Post-Fixierung Schritt optimierte Antikörper Konzentration verwendet, ein Sturm-Puffer mit 10 mM MEA beschrieben in Dempsey⁹ Et Al. optimal für den experimentellen Aufbau und Probentyp zu finden.

Gliazellen express vor allem drei Typen von IF-Proteine: Vimentin, nestin und GFAP (glial fibrillary sauren Protein). Diese drei Proteine erwiesen sich in Astrozyten¹⁴Co polymerisieren. Wir haben bisher gezeigt, mit Höchstauflösung strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SR-SIM), dass diese drei IF-Proteine in der gleichen einzelnen IF Faden zu finden und sie ähnliche Verteilung und Dynamik in Gliazellen ¹⁵anzeigen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen den drei IF-Proteinen Vimentin Färbung als Reporter für das gesamte Netzwerk IF diente. Mit dSTORM, konnten wir zu beheben, wie IF Form Bündel entlang der Mikrotubuli, die war nicht möglich mit Beugung Mikroskopie-Techniken¹⁵begrenzt. Diese Beobachtungen können helfen, zu verstehen wie Vimentin IFs Vorlage Mikrotubuli und regulieren ihren Wachstumskurs, Förderung der Aufrechterhaltung einer Polarität Achse während Zelle Migration¹⁶. Super-Auflösung Schlüsselinformationen auf die gegenseitige Interaktion der beiden Zellskelett Subsysteme zur Verfügung gestellt und brachte einen Einblick in die Verbindung zwischen räumlichen Zuordnung und lokale Funktion Zelltyp spezifische¹⁷sein könnte. Im Allgemeinen kann zweifarbige dSTORM das Übersprechen zwischen Zellskelett Elemente oder andere Arten von Organellen, studieren verwendet werden, vorausgesetzt, dass gute Immunostaining Bedingungen in Bezug auf Dichte und Spezifität erreicht werden. Diese Technik nützlich sein wird, die Zytoskelett Änderungen beobachtet, während Astrogliosis und Glioblastom besser zu charakterisieren, die häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, wo der Ausdruck von IF-Proteinen ist verändert ^{18 ,19,20,21}.

Protocol

(1) Deckgläsern Vorbereitung (Tag1, 30 min) Legen Sie die 18 mm nº1.5H (170 µm + / 5µm) Glasdeckgläser auf einem Kunststoff-Rack. Setzen Sie das Rack in einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit Aceton und für 5 Minuten einweichen. Übertragung des Racks auf einen 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol und für 5 Minuten einweichen. Rack auf eine neue 100-mL-Becherglas gefüllt mit absoluten Ethanol übertragen und stellen Sie den Becher in einem Ultraschall-Reiniger-Ger…

Representative Results

Ein Mikroskop mit 50 mW 405 nm und 100 mW 488, 561 und 642 nm Festkörperlaser, einer EMCCD Kamera 512 x 512, Alpha Plan Apo 100 X / 1,46 Ziel und Band Pass 570-650 / lange Pass 655 Emission Filter diente für die repräsentativen Ergebnisse dargestellt. Abbildung 1A gibt ein Beispiel für Molekül Dichte und Signal Rauschabstand, die während der raw-Bildakquisition verwendet werden sollte. Bilder …

Discussion

Wichtige Schritte im Protokoll

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll, das Artefakte in den dSTORM Bildern von Mikrotubuli und IFs in Gliazellen minimiert. Artefakte können erstellt werden, bei jedem Schritt der Probenvorbereitung und Bildgebung: Fixierung, Blockierung, Immunolabeling, treiben während der Akquisition, suboptimale blinkende Bedingungen²³. Nachfolgend die wichtigsten Schritte auflisten

Reinigung der Deckgläser…

Materials

Minimum Essential Media (MEM)	Gibco	41090-028	cell culture
non essential amino acid	Gibco	1140-050	cell culture 1/100e
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	cell culture 1/100e
Fœtal Bovine Serum	Gibco	10270-106	cell culture 1/10e
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25300-054	cell culture
PBS 10x	fischer scientific	11540486	cell culture
coverslip 18 mm n°1,5H	Marienfield/Dominic dutsher	900556	coverslips
paraformaldehyde (PFA) solution	Sigma	F8775	cell fixation
glutaraldehyde	Sigma	G5882	cell fixation
triton X100	Sigma	T9284	non ionic surfactant. Used for cell fixation
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma	452904-25ML	cell fixation
BSA	Sigma	A7906	sample passivation 3% in PBS
Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse	Sigma	V6630	primary antibodies
Rat anti alpha tubulin	Biorad	MCA77G	primary antibodies
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Fisher scientific	10635923	secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Fisher scientific	10226162	secondary antibodies
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Fisher scientific	T7279	fluorescent beads
Chamlide magnetic chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL
Cysteamine (MEA)	Sigma	30070	for the blinking buffer
glucose oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G0543	for the blinking buffer
glucose	sigma		for the blinking buffer
catalase from bovine liver	Sigma	C9322	for the blinking buffer
Tris (trizma)	Sigma	T1503	for the blinking buffer
Wash-N-Dry coverslip rack	Sigma	Z688568
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	paraffin film
ultrasonic cleaner	Fisher scientific	15-335-6
plasma cleaner	Harrick plasma	PDC-32G-2