الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال
Summary
ويرد إجراء ريفولدينج مجال ملزم يجند بيريبلاسميك dCACHE chemoreceptor والعطيفه الصائمية Tlp3 من إدراج الهيئات وتنقية تؤتي مليغرام كميات من البروتين.
Abstract
ويمكن تسهيل تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس ودراسات هيكلية تهدف إلى توضيح الأساس الجزيئي لخصوصية يجند إلى حد كبير بإنتاج كميات مليغرام من المجالات ملزم يجند نقية، مطوية. محاولات هيتيرولوجوسلي التعبير عن مجالات ملزم يجند بيريبلاسميك تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية (كولاي) غالباً ما يسفر عن استهدافهم في الهيئات المعنية بإدراج. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام المجال ملزم يجند من العطيفة الصائمية (C. الصائمية) تشيموريسيبتور Tlp3 dCACHE بيريبلاسميك كمثال. هذا النهج ينطوي على التعبير عن البروتين يحظى باهتمام كليفابل له6-الوسم، والعزلة واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، بروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا، وتنقية عن طريق التقارب اللوني، متبوعاً بعلامة الإزالة وحجم الاستبعاد اللوني. يتم استخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية لتأكيد الدولة مطوية من البروتين النقي. وقد ثبت أن هذا البروتوكول عموما مفيد لإنتاج كميات مليغرام dCACHE يجند بيريبلاسميك ربط مجالات أخرى تشيموريسيبتورس البكتيرية في نموذج قابل للذوبان وكريستاليسابل.
Introduction
إنزيمية وحركية قد أظهرت أن تلعب أدواراً هامة في إمراضية والعطيفه الصائمية بتشجيع الاستعمار الجرثومي وغزو من المضيف2،،من13. يسمح به البكتيريا للتحرك نحو بيئة أفضل للنمو، كما يسترشد بالإشارات الكيميائية. تنطوي هذه العملية على الاعتراف بالإشارات الكيميائية داخل الخلايا والبيئة بمجموعة من البروتينات يسمى تشيموريسيبتورس، أو محول الطاقة مثل البروتينات (قوة). تشيموريسيبتورس معظم هي جزءا لا يتجزأ من غشاء بروتينات مع يجند اكستراسيتوبلاسميك ملزمة المجال (الإعلان) وفي مجال ترانسميمبراني وفي مجال التنبيه هيولى، هذه الأخيرة التي تتفاعل مع البروتينات التنبيه سيتوسوليك التي ترسل إشارة أن المحركات فلاجلر4،5،،من67.
تم تحديد أحد عشر تشيموريسيبتورس مختلفة في4،الجينوم الصائمية جيم- 8. وحتى الآن، سوى بعض من هذه تشيموريسيبتورس وصفت وهو معروف خصوصية يجند Tlp19و10،Tlp311، Tlp411، Tlp712، و Tlp1113 . تحديد يغاندس الطبيعية تشيموريسيبتورس المتبقية في هذه الأنواع، والعديد من تشيموريسيبتورس في البكتيريا الأخرى، يمكن أن يتيسر إلى حد كبير بإنتاج مطوية ونقية جداً المؤتلف تشيموريسيبتور، لبدس14 15 , 16-بيد أن محاولات للتعبير عن هيتيرولوجوسلي لبدس بيريبلاسميك من تشيموريسيبتورس البكتيرية في الإشريكيّة القولونية غالباً ما يؤدي في استهدافها في الهيئات إدراج17،18،19 . ومع ذلك، يمكن تسهيل هذه الظاهرة العزلة سهلة والانتعاش من البروتين في متناول اليد. هنا، يقدم طريقة لاسترداد البروتين من إدراج الهيئات وريفولدينج وتنقية، استخدام قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور جيم الصائمية Tlp3 كمثال. وقد اختير هذا المثال للإعلان Tlp3 ينتمي إلى الأسرة dCACHE20 من مجالات الاستشعار التي توجد وفرة في مؤنزم الحامض الأميني مكون اثنين وتشيموريسيبتورس في بدائيات النوى20،21، 22 , 23.
في هذا النهج، تم تصميم بنية التعبير، استناداً إلى ناقل pET151/د-توبو، إلى إدراج ن–المحطة طرفية له6-العلامة متبوعاً التبغ أحفر موقع الانقسام مبطلات الفيروس (TEV)، ل إزالة العلامة اللاحقة19. ويصف البروتوكول overexpression البروتين في كولاي، والعزلة، واليوريا بوساطة سولوبيليسيشن إدراج الهيئات، والبروتين ريفولدينج قبل استنفاد اليوريا. بعد ريفولدينج، هو تنقية العينة بالتقارب اللوني، مع علامة اختياري إزالة وحجم الاستبعاد اللوني. ويؤكد الدولة مطوية من البروتين المنقي باستخدام التحليل الطيفي تلوانيه دائرية. هذا هو نسخة معدلة من الأسلوب الذي تم وضعه مسبقاً لاسترداد وتنقية قام تشيموريسيبتور المختلفة، الملوية البوابية تلبك19. غلة هذا الإجراء، تلخص في الشكل 1، 10-20 ملغ قام Tlp3 نقية، وليس تمييز كل 1 لتر ثقافة البكتيرية، بدرجة نقاء بروتين من > 90% حسب تقديرات الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد إجراء بسيط للتعبير وريفولدينج من إدراج الهيئات قام بيريبلاسميك من تشيموريسيبتور الجرثومي Tlp3. إعداد البروتين النقي ينطوي التعبير المفرط عن الجينات بلازميد المرمزة الحيوانات الأليفة في كولايوتنقيتها وسولوبيليسيشن لإدراج الهيئات، ريفولدينج البروتين التشويه والتحريف وتنقية وا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ليو يو جيم لعمله المبكر على إنتاج Tlp3-الإعلان. مايرا ألف ماتشوكا مدين ل Departamento أدميستراتيفو دي العلوم، التكنولوجيا الإلكترونية معهد Innovación للحصول على منحة دكتوراه.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
References
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Biochimie. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Biochimie. 34 (17), 5773-5794 (1995).
