Dissekera multi signalering proteinkomplex av Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP)

Summary

Detta manuskript beskriver protokollet för Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP). Denna nya metod underlättar specifika isolering och nedströms proteomiska karakterisering av några två samverkande proteiner, medan exklusive FN-komplex enskilda proteiner samt komplex bildas med konkurrerande bindande partner.

Abstract

Montering av proteinkomplex är en central mekanism som ligger bakom regleringen av många cell signalering vägar. Ett stort fokus på biomedicinsk forskning dechiffrera hur dessa dynamiska proteinkomplex agera för att integrera signaler från flera källor för att rikta en specifik biologisk reaktion, och hur detta blir avregleras i många sjukdomar inställningar. Trots betydelsen av denna viktiga biokemiska mekanism finns det en brist på experimentella metoder som kan underlätta den specifika och känsliga deconvolution av dessa multi molekylär signalering komplex.

Här åtgärdas denna brist genom kombinationen av en protein komplettering analysen med en konformation-specifika nanobody, som vi har kallat Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP). Denna nya teknik underlättar specifika isolering och nedströms proteomiska karakterisering av alla par av samverkande proteiner, med uteslutande av FN-komplex enskilda proteiner och komplex som bildas med konkurrerande bindande partner.

Den BiCAP tekniken är anpassningsbar till ett brett utbud av nedströms experimentella analyser, och den höga graden av specificitet som ges genom denna teknik tillåter mer nyanserad utredningar av mekaniken i protein komplex sammansättning än för närvarande använder standard affinitet rening tekniker.

Introduction

Protein komplex sammansättning är en viktig process för att upprätthålla många signalering vägar^1,2spatiotemporal specificitet. Medan kritiska arten av denna reglerande roll är allmänt erkänd, finns det en brist på experimentella tekniker tillgängliga att granska dessa komplex. De flesta interactomics studier fokuserar på interaktioner med enskilda proteiner eller sekventiella anrikningen av enskilda komplexa komponenter. Här presenterar vi en teknik för isolering av ett specifikt protein dimer medan exklusive de enskilda delarna av den komponenten proteiner samt komplex bildade med konkurrerande bindande partner³. Vi har kallat denna teknik Bimolecular komplettering affinitet rening (BiCAP), eftersom det är en kombination av en tidigare existerande protein fragment komplettering analys, Bimolecular fluorescens komplettering (BiFC), med ny användning av en exteriör-specifika rekombinant nanobody mot GFP och dess derivat (se tabellen för material).

En typisk protein-fragment komplettering analysen bygger på uttrycket av ”bete” och ”offer” proteiner smält för att dela upp fragment av reportrar som luciferas⁴, β-galaktosidas⁵eller grönt fluorescerande protein (GFP)⁶ ( Figur 1A). Genom samverkan mellan bete och byte proteinerna uppmuntras split reporter domäner refold till en funktionell struktur, vilket gör att samspelet mellan betet och bytesdjur proteiner som ska visualiseras eller kvantifieras. BiCAP var anpassad från en version av denna teknik som gjord använda av fragment av GFP varianten Venus. Fluorescerande protein komplettering analyser är en populär metod för att visualisera protein-protein interaktioner i en levande cell, men hittills har begränsats till detta en funktion⁷. BiCAP utgör ett betydande framsteg i detta avseende, eftersom denna teknik inte bara möjliggör visualisering, men också isolering och förhör av den resulterande protein-protein interaktionen.

Figur 1: den strukturella viktigaste bakom tekniken som BiCAP. (A) en schematisk disposition huvudmannen bakom bimolecular fluorescens komplettering visar ‘bete’ och ‘offer’ proteinerna taggade med N-terminala V1 eller C-terminal V2 fragment av proteinet fullängds Venus. (B) strukturell analys av interaktion gränssnittet (cyan) mellan GFP nanobody (grön) och rekombinerat Venus, visar positionen för V1 (grå) och V2 (orange) fragment (PDB anslutning 3OGO). Denna siffra är ompublicerade fromCroucher et al.³ Reprinted med tillstånd från AAAS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den BiCAP teknik gör användningen av två icke-fluorescerande fragment av Venus (heter V1 och V2) som associeras med en låg grad av samhörighet såvida inte en interaktion sker mellan deras fusion partners. I detta fall refold de två delade domänerna i funktionella β-fat strukturen av fluorophore (figur 1B)⁶. Den viktigaste nyheten i BiCAP kommer från införandet av den rekombinanta GFP-nanobody, som erkänner en tredimensionell epitop på β-fat av god Jordbrukarsed (och varianter såsom Venus) som finns endast på korrekt rekombinerat och vikta fluorophore ( Figur 1B)⁸. Avgörande, binder den GFP nanobody inte till antingen enskilda Venus fragment. Detta underlättar isolering av protein dimerer först efter de två proteinerna har bildat ett komplex av egen vilja, vilket leder till mer representativt resultat än sådana som förvärvats från metoder som gör användningen av kemiskt inducerad, Tvingad interaktioner⁹.

BiCAP är en kraftfull teknik som specifikt fokuserar på flera proteinkomplex, som potentiellt kan kombineras med ett antal efterföljande program för att förbättra precisionen av vår förståelse av dessa komplex roll i Signaltransduktion . Det omfattar också den viktiga funktionen att låta visualisering av protein interaktioner i situ. Hittills har BiCAP har visats som en effektiv metod för att analysera interactome receptor tyrosine kinase (RTK) dimerer³, men anpassningsförmåga i denna metod innebär att den kan antas i nästan alla sammanhang med protein i interaktion.

Protocol

1. plasmid kloning Obs: För att generera plasmid vektorer med V1 eller V2 Taggar smält till N-terminalen eller C-terminus av genen av intresse, BiFC destination vektorer har deponerats med Addgene [N-terminala tag: pDEST-V1-ORF (#73635), pDEST-V2-ORF (#73636). C-terminal tag: pDEST-ORF-V1 (#73637), pDEST-ORF-V2 (#73638)]. Den genen/s av intresse kommer att behöva vara i specifika rekombination kloning kompatibel posten vektorer (dvs pDONR223 eller pENTR221), utan stop kodon, att gå …

Representative Results

Efter användning av rekombination kloning för att generera V1 och V2 taggade gener av intresse med BiFC pDEST plasmidsna, samtidig transfection av två plasmider som innehåller en samverkande par proteiner kommer att resultera i generation av en Venus fluorescerande signal efter 8-24 timmar. I avsaknad av en positiv signal som det är möjligt att protein interaktionen inte kan uppstå på grund av valet av cellinje, en låg transfection effektivitet eller som taggarna BiFC orientering…

Discussion

BiCAP är en kraftfull metod för att isolera specifika protein dimerer medan exklusive de enskilda komponenterna och deras konkurrerande bindande partner³. BiCAP bygger på anpassning av en fluorescens protein komplettering analysen kallas BiFC⁶. Befintliga metoder, inklusive BiFC och närhet ligering analyser, har använts i stor utsträckning att visualisera och kvantifiera proteininteraktioner i levande celler⁷, men lämnade inte ett effektivt s?…

Materials

LR Clonase II Plus enzyme	Thermo Fisher Scientific	12538120	Recombinase enzyme required for Gateway cloning (Step 1) into pDEST BiFC destination vectors
Proteinase K, recombinant, PCR grade	Thermo Fisher Scientific	EO0491
14 mL round-bottomed polypropylene tube	Corning	352059
Ampicillin	Roche Diagnostics Australia	10835242001	Stock solution prepared at 100 μg/mL in distilled water.
Miniprep kit	Promega Corporation	A1330
Maxiprep kit	Life Technologies Australia	K2100-07
DMEM	Gibco	11995-073
FBS	Life Technologies Australia	10099-141
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies Australia	15070-063
jetPRIME transfection buffer	Polyplus	114-15
jetPRIME transfection reagent	Polyplus	114-15
PhosSTOP (Phosphatase inhibitor)	Sigma-Aldrich	4906837001
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Cell Scraper	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	gta-100	GFP nanobody coupled to agarose beads
N-terminal GFP monoclonal antibody	Covance	MMS-118P	Will detect the V1 tag within the BiFC vectors
C-terminal GFP monoclonal antibody	Roche	11814460001	Will detect the V2 tag within the BiFC vectors
Sample buffer	Invitrogen	NP0008	Supplemented with 1 mL β-mercaptoethanol.
Sequencing grade modified trypsin	Promega Corporation	V5117h
LoBind microcentrifuge tubes	Point of Care Diagnostics	0030 108 116
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Prepared at 5 mg/mL in ultrapure water
Trifluoroacetic Acid – Sequanal Grade	Thermo Fisher	10628494
3M Empore solid phase extraction C18 disks (octadecyl) – 4.7 cm	Thermo Fisher	14-386-2	To prepare stage tips, cut 1 mm disks using an appropriately sized hole punch. Alternatively, pre-prepared stage tips can also be purchased, see below.
C18 Stage Tips, 10 µL bed	Thermo Fisher	87782
Formic acid OPTIMA for LC/MS grade 50mL	Thermo Fisher	FSBA117-50
1.9 μm C18 ReproSil particles	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.	Stationary phase particles
Acetonitrile OPTIMA LC/MS grade	Thermo Fisher	FSBA955-4
Easy-nLC HPLC	Thermo Fisher
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Non-ionic detergent (100%)
DH5α cells	Thermo Fisher		Heat-shock-competent cells