Жирные кислоты 13C Isotopologue профилирования обеспечивает проницательность в трофических углерода передачи и метаболизма липидов беспозвоночных потребителей
Summary
Жирные кислоты трофических маркер подход, т.е., ассимиляции жирных кислот как весь молекулы и передачи в потребительских ткани с без или незначительные модификации, препятствуют пробелы в знаниях в метаболизме жирных кислот мелких почвенных беспозвоночных. Isotopologue профилирования предусмотрено как ценный инструмент отделить трофических взаимодействий.
Abstract
Жирные кислоты (ФАС) являются полезным биомаркеров в пищевой сети экологии, потому что они обычно усваивается как полный молекулы и переведены в потребительских ткани с несовершеннолетним или без модификации, позволяя диетических маршрутизации между различными трофическими уровнями. Однако FA трофических маркер подход по-прежнему препятствует ограниченные знания метаболизма липидов почвенной фауны. В настоящем исследовании использованы полностью помечены пальмитиновая кислота (13C16:0, 99% атом) как трассировщик в пути метаболизма жирных кислот два широко почвы ногохвостки, Protaphorura fimata и Heteromurus nitidus. Для того, чтобы расследовать судьбу и метаболические изменения этого прекурсора, представлен метод профилирования isotopologue, выполнено по масс-спектрометрии с помощью одного иона мониторинга. Кроме того описан вверх по течению лаборатории кормления эксперимент, а также добыча и метилирования доминирующей Липидные фракции (нейтральные липиды, фосфолипиды) и соответствующие формулы и расчеты. Isotopologue профилирования не только урожай, общий 13C обогащения в жирные кислоты, полученных от 13C пометкой прекурсоры, но также производит шаблон isotopologues, превышения массы родительского Иона (т.е. Молекулярный ион FA М+) каждого помечены FA на одной или нескольких единицах массы (M+ 1M+ 2M+ 3, и т.д.). Это знание позволяет сделать выводы о соотношении диетических маршрутизации полностью потребляются Англии по сравнению с de novo биосинтеза. Isotopologue профилирование предлагается как полезный инструмент для оценки метаболизма жирных кислот в почвенных животных отделить трофических взаимодействий.
Introduction
В загадочные Хабитат такие почвы трофических связей трудно адрес и далее ограничен небольшой размер фауны. Последнее десятилетие было отмечено прогресса в биохимической экологии, особенно в использовании жирных кислот в качестве биомаркеров для определения стратегии кормления почвенной фауны в полевых условиях1,2,3. Это основано на факте, что жирные кислоты из ресурсов могут быть включены в потребительских ткани как весь молекулы, процесс называется диетических маршрутизации4. Течение трех трофических уровней, т.е. от грибов к струнцы ногохвостки5было сообщено передачи жирных кислот. Недавно хищной фауны считался6,7 , и первые обзоры на жирные кислоты как трофические маркеров в пищевых сетях почвы были опубликованы8,9.
Более подробная информация о трофических взаимодействий достигается стабильный изотоп жирных кислот зондирование (FA-SIP). Определение 13C /12C соотношение жирных кислот в рационе и потребителей могут приписывать двоичные ссылки и оценить поток связанного углерода и был нанят в наземных, пресноводных и морских пищевых сетях10,11 ,12,13. Основное предположение — что диетических перенаправленное жирные кислоты не подлежат ферментативных процессов; Таким образом, их 13C сигнал, т.е. 13C /12C соотношение жирных кислот, в потребитель аналогична в диетические1. Однако постепенное истощение 13C подписи вверх по пищевой цепи поступили в водных системах, тем самым препятствуя широкое применение FA-SIP в трофических исследования14,,1516. Кроме того знания метаболизма липидов в большинстве беспозвоночных в наземных пищевых сетях по-прежнему ограничен.
Понимание путей метаболизма липидов в потребителей имеет важное значение для использования трофических маркер жирных кислот, как средство для определения количественной углерод потока в пищевой сети экологии. Имея это в виду, 13C-isotopologue профилирования, который в принципе может быть применен для исследования метаболизма углеродных любой биологической системы17, является перспективным методом. После введения 13C, меченного углерода субстрата, распределение 13C в метаболических сети прослеживается с сгенерированный метаболических продуктов в шоу потребительской распределение конкретных isotopologue. Это могут быть оценены количественных ядерный резонанс метаболических спектроскопии18,19 или масс-спектрометрии20,21, с последнего благоприятствования в биологических образцов с низкой биомассы из-за его выше чувствительность.
Хотя isotopologue профилирования успешно применяется для аминокислот и предоставляет проницательность в метаболизм углерода в естественных условиях , бактериальных патогенов17,22,23, ее осуществление в жирных кислот отстает. Первый подробный анализ на судьбу стабильного изотопа помечены прекурсоров жирных кислот, ее диетических маршрутизации или деградации через β-окисления, в почве беспозвоночных потребителей, недавно была исполнена Мензел и др. 24. здесь, методологические основы для включения экспериментов с 13C маркировкой жирные кислоты, а затем isotopologue анализ ключевых потомков в частых почвенных беспозвоночных, ногохвостки, предоставляются. Эти microarthropods являются хорошей моделью группой, поскольку они являются важными компонентами почвы пищевой сети и хорошо исследованы на8,их трофических маркер в жирные кислоты25.
Понимание путей метаболизма липидов в потребителей имеет важное значение для использования трофических маркер жирных кислот, как средство для определения количественной углерод потока в пищевой сети экологии. Настоящий протокол дает проектирование и настройка для кормления эксперимент и биохимическими процедурами для извлечения и метилирования доминирующей липиды фракций (нейтральные липиды, фосфолипиды) от ногохвостки лаборатории. Он демонстрирует, как isotopologue состав жирных кислот анализируется по масс-спектрометрии и описывает связанные формулы и расчеты. Эта процедура приводит к: (i коэффициентов превышения массы родительского Ион (т.е., жирные кислоты Молекулярный ион М+) на один или более isotopologues массы единицы (M+ 1M+ 2M+ 3, и т.д.) и (ii) общий 13 C обогащения в жирные кислоты, производный от 13C маркировкой прекурсоров. Хотя используется для ногохвостки, этот подход как правило может применяться к любой другой хищник жертва взаимодействия на той предпосылке, что они culturable в достаточном количестве в контролируемых условиях для обеспечения успешного лейбл поглощения и последующих Проверка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopologue профилирование
Подробный анализ количественных аспектов в 13C распределения в ФАС требует передовые технологии для присвоения углерода, секционирование в пищевых цепях. Настоящая работа занятых isotopologue профилирования оценить 13C /12C коэф?…
Acknowledgements
Финансовой поддержке р. Мензел и L. Ruess, Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) с благодарностью. Р. Неринг финансировалась RU 780/10-1. Наконец мы чрезвычайно благодарны доктор Hazel Ruvimbo Мабореке для корректуры наши рукописи.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
