חומצת שומן 13C איזוטופולוג פרופיל מספק תובנה מטבולי של הגעה צרכנים והעברת פחמן עם מחלות
Summary
חומצת שומן מרקר עם מחלות הגישה, קרי, ההטמעה של חומצות שומן כמו כל מולקולה והעברת לתוך רקמות לצרכן ללא או משנית השינוי, היא הקשו על ידי פערי ידע חומצת שומן חילוף החומרים של אדמה קטנים חסרי חוליות. איזוטופולוג פרופיל מסופק כלי חשוב כדי disentangle אינטראקציות עם מחלות.
Abstract
חומצות שומן (FAs) הם סמנים שימושיים אקולוגיה מארג מזון כי הם בדרך כלל מתבוללת כ מולקולה להשלים, להעביר לתוך רקמות לצרכן עם הקטין או ללא כל שינוי, המאפשר את ניתוב התזונה בין רמות הזנה שונות. עם זאת, הגישה מרקר עם מחלות הפא היא עדיין הקשו על ידי הידע מוגבל בנוזל מטבולי של צומח הקרקע. מחקר זה משמש עם תוויות ברורות לגמרי חומצה פלמיטית (13C16:0, 99% אטום) מכשיר מעקב במשעולים חומצת שומן חילוף החומרים של הקרקע בהיקף נרחב שני Collembola, Protaphorura fimata , Heteromurus nitidus. על מנת לחקור את גורלם ואת שינויים מטבוליים של קודמן הזה, שיטת איזוטופולוג פרופיל מוצגת, המבוצעת על ידי ספקטרומטר מסה באמצעות ניטור יון בודד. יתר על כן, המעבדה במעלה האכלה הניסוי מתוארת, כמו גם החילוץ מתילציה של שברים השומנים דומיננטי (ליפידים נייטרלי, פוספוליפידים) ואת הנוסחה קשורים חישובים. איזוטופולוג פרופיל אינה רק התשואה העשרת 13C הכוללת בחומצות שומן נגזר 13ג שכותרתו קודמן אך גם יוצרת התבנית של isotopologues העולה על המסה של האב יונים (קרי, יונים מולקולרית פא ז+) של כל אחד עם התווית הפא על-ידי יחידות מסה אחת או יותר (מ’+1, מ’+2, מ’+3, וכו ‘). ידע זה מאפשר מסקנות על היחס של ניתוב התזונה הפא נצרך לחלוטין בהשוואה ביוסינטזה de novo . איזוטופולוג פרופיל המוצע ככלי שימושי עבור הערכה של חומצת שומן חילוף החומרים לבעלי הקרקע disentangle אינטראקציות עם מחלות.
Introduction
בבית גידול נסתר כגון אדמה, יחסים עם מחלות קשה כתובת, מוגבלים עוד יותר לפי גודל קטן החי והצומח. בעשור האחרון חלה התקדמות אקולוגיה הביוכימי, במיוחד בשימוש של חומצות שומן כמו סמנים ביולוגיים עבור הגדרת אסטרטגיות האכלה של צומח הקרקע תחת השדה תנאים1,2,3. זה מבוסס על העובדה כי חומצות שומן מכל המשאבים ניתן לשלב ברקמת הצרכן כמו במולקולות שלמות, תהליך הנקרא ניתוב התזונה4. העברה של חומצות שומן דווח על שלוש הזנה רמות, קרי, מן ופטריות על נמטודות Collembola5. לאחרונה, החי והצומח דורסנית נחשבה6,7 , הראשון על חומצות שומן כסמנים עם מחלות במארג המזון בקרקע הביקורות שפורסמו8,9.
מידע מפורט יותר על אינטראקציות עם מחלות מושגת באיזוטופ יציב חומצת שומן חיטוט (פא-SIP). הקביעה של 13C /12C יחסי בחומצות שומן בפח דיאטות ולצרכנים לייחס קישורים בינארי, מעריכים את זרימת פחמן הקשורים ננקטה יבשתי, מים מתוקים, ו במארג המזון ימית10,11 12, ,13. הנחת היסוד היא כי חומצות שומן מנותבים תזונתיים אינם כפופים תהליכים אנזימטי; לכן, שלהם 13ג אות, קרי, 13C /12C יחס של חומצת השומן של הצרכנים דומה לזה דיאטה1. עם זאת, דלדול הדרגתי של החתימה 13C במעלה שרשרת המזון דווח במערכות הימית, ובכך פוגע יישום נרחב של פא-SIP מחקרים עם מחלות14,15,16. יתר על כן, הידע המטבוליזם השומנים לרוב חסרי חוליות ב במארג המזון הארצי הוא עדיין מוגבל.
הבנה של המסלולים מטבוליזם השומנים ב צרכנים חיונית עבור השימוש של חומצות שומן מרקר עם מחלות כמו אומר מצפני הזרם פחמן כמותית ב אקולוגיה מארג מזון. עם זאת בחשבון, 13C-איזוטופולוג פרופיל, ניתן להחיל על איזה עיקרון בתוך לחקירה של חילוף החומרים פחמן של כל מערכות גוף17, היא שיטה מבטיחה. בעקבות כניסתה של מצע מתויג C פחמן 13, ההתפלגות של 13C ברשת מטבולית הוא אתנו מאז המוצרים מטבולית שנוצר במופע הצרכן התפלגות איזוטופולוג ספציפיים. זה יכול להיות מוערך על ידי כמותיים תהודה מטבולית גרעיני ספקטרוסקופיה18,19 -ספקטרומטר מסה20,21, עם דגימות ביולוגיות המועדף ב האחרון עם ביומסה נמוכה בשל שלה גבוה יותר רגישות.
למרות איזוטופולוג פרופיל כולל כבר בהצלחה שהוחל חומצות אמינו, מסופק תובנה ויוו פחמן חילוף החומרים של פתוגנים חיידקיים17,22,23, יישומה של שומן חומצות פיגר אחרי. ניתוח מפורט הראשון על גורלה של איזוטופ יציב מתויג קודמן חומצת שומן, תזונה ניתוב או השפלה ויה β-חמצון, אדמת הגעה הצרכנים, לאחרונה בוצע על ידי מנזל. et al. 24. כאן, היסודות מתודולוגי לניסויים התאגדות עם 13C מתויג חומצות שומן ואחריו איזוטופולוג ניתוח של צאצאי מפתח באדמה תכופות חסרי חוליות, Collembola, הינם מסופקים. Microarthropods אלה הם קבוצה טובה הם מהווים מרכיבים חשובים של מארג המזון של הקרקע, הם נחקרים על שלהם מרקר עם מחלות8,של חומצות שומן25היטב.
הבנה של המסלולים מטבוליזם השומנים ב צרכנים חיונית עבור השימוש של חומצות שומן מרקר עם מחלות כמו אומר מצפני הזרם פחמן כמותית ב אקולוגיה מארג מזון. בפרוטוקול הנוכחי נותן את העיצוב ואת הגדר מעבדה האכלה Collembola ניסוי, וההליכים הביוכימי החילוץ של מתילציה של שברים דומיננטי ליפידים (שומנים נייטרלי, פוספוליפידים). זה מדגים איך ההרכב איזוטופולוג של חומצות שומן ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה, מתאר את הנוסחה קשורים של חישובים. הליך זה מתבטא: (i) את היחס של isotopologues העולה על המסה של האב יונים (קרי, יון מולקולרית חומצת שומן M+) על ידי אחד או יותר המוני יחידות (מ’+1, מ’+2, מ’+3, וכו ‘) ו- (ii) הכולל 13 C העשרה בחומצות שומן נגזר למבשר 13C עם תוויות ברורות. למרות שימוש עבור Collembola, גישה זו בדרך כלל ניתן להחיל על כל אינטראקציה עם טורף-טרף אחרים על ההנחה כי אלה culturable בכמות מספקת בתנאים מבוקרים כדי להבטיח ספיגת תווית מוצלחת ובעקבות אימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
איזוטופולוג פרופיל
ניתוח מפורט של היבטים כמותיים בחלוקת 13C ב FAs צריך טכנולוגיה חדשנית כדי להקצות פחמן חלוקה למחיצות בבמארג המזון. העבודה הנוכחית המועסקים איזוטופולוג פרופיל כדי להעריך את 13C /12C יחסי של סמנים פא נפוצות עבור אינטראקציות טרופי. שיטה ?…
Acknowledgements
התמיכה הכלכלית של ר’ מנזל, ל’ Ruess על ידי פתוח (RU RU780/11-1) הוא הודה בהכרת תודה. ר’ Nehring מומן על ידי-RU 780/10-1. בסופו של דבר, אנחנו מאוד אסיר תודה ד ר לוז Ruvimbo Maboreke להגהת כתב היד.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
References
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
