Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple et utile pour stocker le sang périphérique et le sérum/plasma pour des analyses en aval comme single nucleotide polymorphisme (SNP) évaluation et analyse d’ELISA.

Résumé

Qualité d’échantillon de sang est essentielle pour assurer des analyses précises en aval comme la PCR en temps réel ou de ELISA. Un stockage correct des matériaux biologiques est le point de départ pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Tous les échantillons doivent être traités de la même manière de collecte de sang au stockage. Selon les analyses à effectuer, le sang et les échantillons de sérum doivent être conservées à-20 ° C ou à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Des échantillons de sérum sanguin/devraient également être aliquotés pour éviter les multiples de gel-dégel. Une autre question importante est les conditions de l’échantillon lors de l’expédition d’un laboratoire à l’autre. Si la glace sèche n’est pas disponible ou l’expédition prend plue que quelques jours, autres approches sont nécessaires. Une option consiste à utiliser le papier filtre pour la collecte de sang. Ici, nous proposons une méthode pour le sang et le prélèvement d’échantillons de sérum qui profite du sang séché (DBS) et séché de sérum (DSS). Nous avons développé la procédure pour extraire l’ADN de DBS pour l’évaluation en aval de quelques simples de nucléotide simple (SNP) par PCR en temps réel. Nous avons également optimisé un test ELISA à partir de protéines éluées de DSS. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres tests ELISA ou les procédures d’évaluation des protéines.

Introduction

L’objectif principal de la recherche sur les biomarqueurs du cancer est l’identification de nouveaux paramètres biologiques qui peut être utilisé pour le diagnostic, pour prédire pronostic patient et pour déterminer si un patient va réagir à un traitement spécifique. Ce domaine de recherche est fondamental pour la découverte de traitements novateurs contre le cancer et joue un rôle clé dans le traitement sur mesure.

Les procédures effectuées au cours de chaque étape de l’identification de biomarqueurs et de validation doivent être fiables et reproductibles. Des pierres angulaires du succès de la recherche translationnelle sont le stockage correct des échantillons biologiques comme le sang et le sérum. Il s’agit de la première étape vers l’obtention de matériel biologique de qualité qui peut être utilisé pour effectuer des expériences de biologie moléculaire ou analyses de protéines.

Études multicentriques sont souvent nécessaires pour recruter suffisamment patients pour obtenir des données fiables. Pas tous les instituts sont en mesure de conserver les échantillons à-80 ° C ou à envoyer des échantillons d’autres centres internationaux en glace sèche. L’utilisation de papier filtre pour la collecte de sang est une méthode simple pour le stockage de sérum et sang et ne nécessite pas le gel immédiat des échantillons^1,2. Une goutte de sang ou de sérum peut être repérée sur le papier, laissé sécher pendant la nuit et puis stocké pendant jusqu'à 14 jours à température ambiante^1,2. Cela donne des chercheurs de temps pour envoyer les échantillons d’autres laboratoires. L’utilisation de sang séché taches (DBS) et taches séchées de sérum (DSS) pourraient ainsi simplifier la collaboration entre les instituts dans les pays développés et en développement.

Compte tenu de sa facilité d’utilisation, l’échantillonnage DBS est largement utilisé dans plusieurs types d’analyses pour des analyses sérologiques ou génétiques en aval. Par exemple, dans le passé, la DBS étaient fréquemment utilisés pour le VIH dans les pays en développement^1,2,3,4,5. Un autre avantage de cette méthode de stockage est peuvent percevoir des échantillons de sang du doigt-pique, ce qui permet son utilisation pour le dépistage des essais ^6,7,8. Exemple simple de manutention et de transport sont a d’autres avantages de DBS, surtout pour les échantillons prélevés dans les sites distants où il n’y a aucun équipement de laboratoire. Dans une publication précédente, nous avons utilisé DBS et DSS pour tester la vitamine D et vitamine D protéine de liaison (DBP) dans une série de patients caucasiens et africaine⁹. Nos collègues africains n’étaient pas en mesure d’obtenir de la glace sèche. Pour comparer les marqueurs biologiques pour comprendre les différences dans la voie de la vitamine D entre les deux populations ethniques, nous avons encore amélioré la procédure en utilisant des échantillons appariés, stockés dans des conditions normales et sur papier filtre. Après avoir optimisé la procédure DBS/DSS, nous avons pu analyser DBP et vitamine D dans le sérum de patients dans les deux cohortes. Nous avons également évalué un certain nombre de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) après extraction de l’ADN du sang pour les personnes de race blanche et de DBS pour africains⁹. Le présent protocole permet des échantillons de sang de haute qualité doivent être conservés à température ambiante sans affecter les différents types d’analyses en aval allant de la biologie moléculaire aux tests ELISA. Il est recommandé pour une utilisation gérer les matières biologiques dans des études multicentriques ou pour les centres qui n’ont pas d’installations pour des conditions de stockage standard. Le protocole suivant représente l’aboutissement de ces procédures optimisées.

Protocole

Sérum et le sang périphérique ont été recueillies et stockées de donneurs sains et de patients qui ont donné le consentement éclairé pour participer à l’étude. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité d’éthique local conformément aux normes éthiques fixés dans la déclaration d’Helsinki de 1964.

1. sang entreposage à DBS

1. Prélèvement d’échantillons de sang
   1. Collecter 3 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube de 3 mL avec 5,4 mg d’acide tétraacétique (EDTA).
      NOTE : Stocker le sang périphérique comme DBS dès que possible et dans les 8 h.
   2. Écrire le numéro de code du patient sur le coin inférieur droit de la carte de la veille.
   3. Soigneusement Resuspendre le sang avec une pipette de 5 mL.
2. Sang sur DBS
   1. Pipette et une tache de sang (50 µL) sur la carte de la veille (Table des matières), avec une pointe de 50 à 200 µL de transfert.
   2. Répétez l’étape 1.2.1. pour avoir un total de 3 à 5 gouttes de sang. Jeter la vieille pointe et prendre un nouveau pour chaque sang aliquote.
   3. Laissez la DBS sécher jusqu’au lendemain à la température ambiante à l’horizontale sur une surface non absorbante ouverte, en évitant les rayons directs du soleil. Laissez le couvercle de la carte de veille ouvert pour faciliter le séchage du sang.
      Remarque : Les particules dans l’air ou de poussières au cours de cette étape de séchage n’affecte pas les applications en aval.
   4. Conserver la carte à la température ambiante dans un sac plastique avec déshydratant jusqu'à l’utilisation.

2. Extraction de l’ADN à partir de DBS selon la feuille de données ADN Extraction Kit (Section pour les taches de sang séché)

1. Préparation des échantillons
   1. Utilisez 3 gouttes de sang séché de la carte. Couper chacune des taches de sang séché de la carte et les séparer de la carte avec des pincettes. Couper les taches de sang séché séparés en petits morceaux (diamètre d’environ 1 mm).
   2. Placer les petits morceaux dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
2. Digestion de l’échantillon
   1. Ajouter 180 µL de tampon de lyse 1 fourni dans le kit (Table des matières) dans le tube. Ajouter 20 µL de protéinase K. Ne mélangez pas le tampon de lyse 1 avec la protéinase k avant pipettant également, dans le tube de 1,5 mL de sang repéré la carte. Mélanger au vortex.
   2. Placer le tube dans un thermoincubator et laisser incuber à 56 ° C pendant 60 min. Si le thermoincubator n’est pas équipé d’un agitateur, vortex l’échantillon toutes les 10-15 min pendant au moins 10 s, en prenant soin de ne pas pour laisser la température de l’échantillon à diminuer. Brièvement centrifuger les tubes pour retirer le couvercle des gouttes.
3. Pas de lavage
   1. Ajouter 200 µL de tampon de lyse 2 (Table des matières) et vortexer pendant 10 s.
   2. Placer les tubes dans un thermomixer ou incubateur orbital chauffée et incuber à 70 ° C pendant 10 min. Si le thermoincubator n’est pas équipé d’un agitateur, vortex les échantillons une fois pendant au moins 10 s, en prenant soin de ne pas pour laisser la température des échantillons à diminuer.
   3. Répétez l’étape 2.3.1. Transférer les 400 µL de lysat du tube 1,5 mL à colonne élution (Table des matières). Centrifuger la colonne à 6 000 x g pendant 1 min.
   4. Placer la colonne élution dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.
   5. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 1 (Table des matières) et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
   6. Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.
   7. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2 (Table des matières) et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
   8. Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL et jeter le vieux un.
   9. Centrifuger à 20 000 x g pendant 3 minutes sécher la membrane.
4. Étape d’élution
   1. Placer la colonne dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL et jeter le tube de prélèvement.
   2. Place 50 µL d’eau distillée sur le centre de la membrane. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
   3. Centrifuger le tube à 20 000 x g pendant 1 min. recueillir l’éluat et placer à nouveau sur le centre de la membrane.
   4. Centrifuger le tube à 20 000 x g pendant 1 min. jetez la membrane.
   5. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
   6. ADN de magasin à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
      NOTE : ADN extrait de DBS permet d’effectuer plusieurs analyses comme une évaluation SNP par séquençage de PCR en temps réel ou ADN Sanger.

3. sérum stockage pour DSS

1. Prélèvement d’échantillons de sang
   1. Recueillir 7 mL d’échantillon de sang périphérique dans un tube de 7 mL sans EDTA. Laisser l’échantillon de sang à coaguler pendant 30 min à température ambiante.
   2. Écrire le numéro de code du patient sur le coin inférieur droit de la carte de la veille.
   3. Centrifuger l’échantillon de sang à 980 x g pendant 15 min à température ambiante.
      NOTE : Stocker sérum comme DSS dès que possible et dans les 8 h.
   4. Retirez délicatement le surnageant du tube et transférez-le dans un nouveau tube de 15 mL. Soigneusement Resuspendre le sang avec une pipette de 5 mL.
2. Sérum dans DSS
   1. Pipette et transférer un spot de sérum (50 µL) sur la carte de la veille. Répétez cette étape pour un total de 3 à 5 gouttes de sang.
      Remarque : Veillez à distribuer exactement 50 µL de sérum dans chaque tache. Sérum ne devrait pas aller au-delà de la ligne en pointillé de la carte.
   2. Laissez le DSS sécher jusqu’au lendemain à la température ambiante. Laissez le couvercle de la carte de veille ouvert pour faciliter le séchage du sang.
   3. Conserver la carte à la température ambiante dans un sac plastique avec déshydratant jusqu'à l’utilisation. Si le stockage est plu de 14 jours, stocker la carte à-20 ° C.

4. analyse ELISA à partir de DSS

1. Éluer les protéines de DSS.
   1. Si nécessaire, décongeler un SSD pour chaque échantillon. Couper DSS en petits morceaux (environ 1 mm de diamètre). Mettez les morceaux dans un tube de 1,5 mL avec 400 µL de PBS.
   2. Agiter les échantillons durant la nuit à 4 ° C.
      NOTE : Secouer à faible intensité. PBS ne devraient pas mouiller le couvercle du tube pendant la secousse.
2. Utiliser l’éluat de protéine comme un échantillon de sérum pour l’analyse de facteur de croissance/protéine sécrétée selon les instructions du kit ELISA, après des dilutions appropriées.
   Remarque : Cette procédure fonctionne bien pour la détection de DBP⁹. Pour les autres tests ELISA, une étape d’optimisation peut-être être nécessaires.

Résultats

Nous avons profité des DBS et DSS procédures pour stocker le sang et le sérum à la température ambiante sans affecter la qualité de la matière biologique. La figure 1 montre un exemple de l’épargnant de carte de protéines sans sang et après prélèvement sanguin. Afin de confirmer que le stockage sur un papier filtre et la procédure pour éluer sang n’interfèrent pas avec la qualité de l’échantillon, nous avons effectué une comparaison avec les méthodes de stock...

Discussion

Le présent protocole examine le potentiel pour le stockage de sérum et sang sur un papier filtre lorsque les laboratoires n’ont pas le personnel ou les infrastructures nécessaires pour la manipulation correcte des échantillons de sang. En particulier, le sang ou le sérum recueillis dans des tubes standards ou par piqûre doigt peut être stockée à l’aide de cette méthode et il n’y a pas besoin de congeler les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C immédiatement après le prélèvement de sang. DBS/DSS peut rester à température amb...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Whatman protein saver cards 903 Carte d’économie de protéines, 100/pk&lrm ;	Sigma	Z761575	Utile pour stocker les échantillons à température ambiante pour les analyses en aval
Pipettes sérologiques Falcon, 5 mL	Cellule souche	#38003
50-200 µ ; L tips	Star-Lab	S1120-8810
Tube à centrifuger de 1,5 mL	Eppendorf	4036-3204
Microkit d’ADN QIAamp	Qiagen	56304	Il s’agit d’un kit d’extraction d’ADN conçu pour isoler de petites quantités d’ADN.   ;
Tampon ATL (inclus dans le microkit QIAamp DNA)	Qiagen		Ceci est signalé comme Tampon de lyse 1 dans le texte
Tampon AL (inclus dans le microkit QIAamp DNA)	Qiagen		Ceci est signalé comme Tampon de lyse 2 dans le texte
QIAamp mini élu colonne	Qiagen		Ceci est signalé comme colonne dans le texte
AW1  ; (inclus dans le microkit QIAamp DNA)	Qiagen		Ceci est signalé comme Tampon de lavage 1 DANS LE TEXTE
AW2  ; (inclus dans le microkit QIAamp DNA)	Qiagen		Ceci est signalé comme Wash Buffer 2 dans le texte
Vitamine D humaine BP Quantikine ELISA Kit	R& D systems	DVDBP0