יבש הדם ולנקודות סרום ככלי שימושי עבור אחסון מדגם להעריך סמנים ביולוגיים לסרטן
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה שימושי לאחסון דם היקפיים, סרום/פלזמה עבור ניתוחים במורד הזרם כמו assay אליסה והערכת פולימורפיזם (הסנ פ) של נוקלאוטיד יחיד.
Abstract
איכות דגימת הדם חיונית על מנת להבטיח מדויק במורד הזרם ניתוחים כגון PCR בזמן אמת או אליסה. אחסון נכון של חומרים ביולוגיים היא נקודת המוצא על מנת להשיג תוצאות אמין הדירים. כל דוגמאות יש להתייחס באותו אופן מאוסף דם לאחסון. בהתאם הבדיקות שיש לבצע, דם ואת הדוגמאות סרום לאחסן ב-20 ° C או -80 ° C עד השימוש. דגימות דם/בסרום צריכים להיות גם aliquoted כדי להימנע ההקפאה-מפשיר מרובים. נושא חשוב נוסף הוא התנאים מדגם במהלך המשלוח מן המעבדה אחד למשנהו. אם קרח יבש אינו זמין או המשלוח לוקח יותר זמן מאשר מספר ימים, גישות אלטרנטיביות נחוצים. אפשרות אחת היא להשתמש נייר סינון עבור איסוף דם. כאן, אנו מציעים שיטה לדם, אוסף דגימת נסיוב מנצל מיובשים כתמי דם (DBS) ומייבשים סרום כתמים (DSS). פיתחנו את ההליך כדי לחלץ את הדנ א מ- DBS על הערכה במורד הזרם של כמה פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) על-ידי בזמן אמת PCR. אנחנו גם אופטימיזציה של assay אליסה החל מחלבונים eluted מ- DSS. ניתן להשתמש בשיטה זו עם אליסה מבחני או נהלים להערכת חלבונים אחרים.
Introduction
המטרה העיקרית של המחקר לתוך סמנים ביולוגיים לסרטן הוא הזיהוי של פרמטרים ביולוגי חדש שניתן להשתמש בהם לצורך אבחון, על נבואה פרוגנוזה החולה ועל לקביעת אם החולה יגיב טיפול מסוים. אזור זה מחקר בסיסי בזכות הגילוי של טיפולים חדשניים בסרטן, ממלא תפקיד מרכזי בטיפול המותאמים.
ההליכים שבוצעו במהלך כל שלב של סמן זיהוי ואימות חייב להיות אמין לשחזור. אבן היסוד להצלחת המחקר translational הוא אחסון נכון של דגימות ביולוגיות כגון דם בסרום. זהו הצעד הראשון לקראת קבלת חומר ביולוגי באיכות גבוהה יכול לשמש לביצוע ניסויים בביולוגיה מולקולרית או מבחני חלבון.
לעתים קרובות נדרשים מחקרים multicenter לגייס מספיק מטופלים כדי לקבל נתונים. לא כל המוסדות מסוגלים לאחסן דגימות ב-80 מעלות צלזיוס או לשלוח דוגמאות למרכזי בינלאומיים אחרים בתוך קרח יבש. השימוש של נייר סינון עבור איסוף דם הוא שיטה פשוטה לאחסון דם, סרום, לא דורשת על הקפאת מיידית של דגימות1,2. טיפה של דם או סרום ניתן הבחין על הנייר, הוריש בן לילה יבש ולאחר מכן מאוחסן עד 14 ימים בטמפרטורת החדר1,2. זה נותן חוקרים הזמן לשלוח הדגימות למעבדות אחרות. השימוש של דם יבש יבחין (DBS), כתמים יבשים סרום (DSS) יכול ובכך לפשט את שיתוף הפעולה בין מוסדות במדינות מפותחות ומתפתחות.
בהתחשב קלות השימוש, DBS הדגימה הוא בשימוש נרחב מספר סוגים של מבחני עבור ניתוחים במורד הזרם סרולוגית או גנטי. לדוגמה, בעבר, DBS שימשו לעתים קרובות ל- HIV הקרנת במדינות מתפתחות1,2,3,4,5. יתרון נוסף של שיטה אחסון זו הוא כי ניתן לאסוף דגימות דם מן האצבע דקירות, ובכך מאפשר את השימוש בו עבור הרך הנולד ההקרנה בדיקות- 6,–7,–8. טיפול קל מדגם ואמצעי התחבורה נמצאים עוד יתרונות DBS, במיוחד עבור הדגימות שנאספו באתרים מרוחקים איפה שיש אין ציוד מעבדה. בפרסום הקודם, היינו DBS ו- DSS בדיקת ויטמין D, ויטמין D מחייב חלבון (DBP) בסדרה של חולים קווקזי ואפריקה9. עמיתינו אפריקה לא היו מסוגלים לקבל קרח יבש. כדי להשוות את סמנים ביולוגיים כדי להבין את ההבדלים בשביל ויטמין D בין שתי האוכלוסיות אתני, שיפרנו עוד יותר את ההליך באמצעות דגימות מתאימים מאוחסנים בתנאים רגילים ולא על נייר סינון. לאחר מיטוב ההליך DBS/DSS, היינו יכולים לנתח DBP וויטמין D בנסיוב החולה ב שני גדודים. אנחנו גם הערכה של מספר של נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs) לאחר מיצוי הדנ א דם בשביל אחוזי ומן DBS אפריקאים9. בפרוטוקול הנוכחי מאפשר באיכות גבוהה דגימות דם לאחסן בטמפרטורת החדר מבלי להשפיע על סוגים שונים של ניתוחים במורד הזרם ועד אליסה מבחני ביולוגיה מולקולרית. מומלץ לשימוש לניהול חומרים ביולוגיים במחקרים multicenter או עבור מרכזי שאין מתקנים תנאי אחסון סטנדרטית. פרוטוקול הבאים מייצג את שיאו של הליכים אלה ממוטבת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה חוקר את הפוטנציאל לאחסון דם, סרום על נייר סינון כשאין המעבדות את צוות או תשתיות לצורך הטיפול הנכון של דגימות דם. בפרט, דם מלא או סרום שנאספו צינורות רגיל או על ידי האצבע-שמוק ניתן לאחסן באמצעות שיטה זו, אין צורך להקפיא דוגמיות ב-20 ° C או -80 ° C מיד לאחר איסוף דם. DBS/DSS יכולים להישאר בט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
