Secchi di sangue e siero macchie come uno strumento utile per la conservazione dei campioni valutare biomarcatori del cancro
Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice e utile per memorizzare sangue periferico e del siero/plasma per analisi a valle, quali single nucleotide polymorphism (SNP) valutazione e analisi di ELISA.
Abstract
Qualità del campione di sangue è fondamentale per garantire l’accurata analisi a valle, quali ELISA o PCR in tempo reale. Corretta conservazione dei materiali biologici è il punto di partenza per ottenere risultati riproducibili e affidabili. Tutti i campioni devono essere trattati allo stesso modo da prelievo di sangue per deposito. In base alle analisi da eseguire, sangue intero e campioni di siero dovrebbero essere conservati a-20 ° C o da-80 ° C fino all’utilizzo. Campioni di siero di anima dovrebbero anche essere aliquotati per evitare più di congelamento-scongelamento. Un’altra questione importante è le condizioni del campione durante la spedizione da un laboratorio a altro. Se il ghiaccio secco non è disponibile o la spedizione richiede più di pochi giorni, sono necessari approcci alternativi. Un’opzione consiste nell’utilizzare la carta da filtro per la raccolta del sangue. Qui, vi proponiamo un metodo per sangue e raccolta del campione di siero che si avvale di secca macchie di sangue (DBS) e asciugato macchie del siero (DSS). Abbiamo sviluppato la procedura per estrarre il DNA da DBS per la valutazione a valle di alcuni polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) con real time PCR. Abbiamo inoltre ottimizzato saggio ELISA a partire da proteine eluite da DSS. Questo metodo può essere utilizzato con altri saggi ELISA o procedure di valutazione di proteine.
Introduction
L’obiettivo principale della ricerca in biomarcatori del cancro è l’identificazione di nuovi parametri biologici che possono essere utilizzati per la diagnosi, per predire la prognosi paziente e per determinare se un paziente risponderà ad un trattamento specifico. Questa area di ricerca è fondamentale per la scoperta delle terapie antitumorali innovativi e svolge un ruolo chiave nel trattamento su misura.
Procedure effettuate durante ogni passaggio del biomarcatore individuazione e la convalida devono essere affidabile e riproducibile. Un elemento fondamentale per il successo della ricerca traslazionale è la corretta conservazione dei campioni biologici quali sangue e siero. Questo è il primo passo verso l’ottenimento di materiale biologico di alta qualità che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di biologia molecolare o analisi proteina.
Studi multicentrici sono spesso necessarie per reclutare abbastanza pazienti per ottenere dati affidabili. Non tutti gli istituti sono in grado di conservare i campioni a-80 ° C o di inviare campioni di altri centri internazionali in ghiaccio secco. L’uso di carta da filtro per la raccolta del sangue è un metodo semplice per la memorizzazione di sangue e siero e non richiede il blocco immediato di campioni1,2. Una goccia di sangue o di siero possa essere individuata sulla carta, lasciato ad asciugare durante la notte e poi conservati per fino a 14 giorni a temperatura ambiente1,2. In questo modo i ricercatori tempo per inviare i campioni ad altri laboratori. L’uso di sangue secco macchie (DBS) e macchie secche del siero (DSS) così potrebbero semplificare la collaborazione tra istituti di paesi in via di sviluppo.
Data la sua facilità d’uso, DBS campionamento è ampiamente utilizzato in diversi tipi di analisi per analisi sierologiche o genetiche a valle. Ad esempio, in passato, DBS erano utilizzati frequentemente per l’HIV di screening in paesi in via di sviluppo1,2,3,4,5. Un altro vantaggio di questo metodo di deposito è che possono essere raccolti campioni di sangue dal dito-punture, permettendo così il suo uso per test 6,7,8di screening neonatale. Facile manipolazione e trasporto sono ulteriori vantaggi di DBS, specialmente per campioni raccolti in siti remoti dove non c’è nessuna attrezzatura di laboratorio. In una pubblicazione precedente, abbiamo utilizzato DBS e DSS a prova di vitamina D e vitamina D proteina (DBP) in una serie di pazienti caucasici e africano9. I nostri colleghi africani non erano in grado di ottenere ghiaccio secco. Per confrontare i marcatori biologici per comprendere le differenze nella via di vitamina D fra le due popolazioni etniche, abbiamo ulteriormente migliorato la procedura utilizzando abbinati i campioni conservati in condizioni standard e su carta da filtro. Dopo l’ottimizzazione della procedura DBS/DSS, siamo stati in grado di analizzare il DBP e la vitamina D nel siero del paziente in due coorti. Inoltre abbiamo valutato una serie di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) dopo estrazione del DNA da sangue intero per i caucasici e da DBS per gli africani9. Il presente protocollo permette i campioni di sangue di alta qualità per essere conservato a temperatura ambiente senza influenzare diversi tipi di analisi a valle che vanno dalla biologia molecolare a dosaggi ELISA. È consigliabile per l’uso gestire materiali biologici in studi multicentrici o per i centri che non dispongono di strutture per le condizioni di conservazione standard. Il seguente protocollo rappresenta il culmine di queste procedure ottimizzate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo indaga il potenziale per la conservazione di sangue e siero su carta da filtro quando i laboratori non hanno il personale o le infrastrutture necessarie per la corretta gestione dei campioni di sangue. In particolare, sangue intero o siero raccolti in provette standard o da puntura del dito possa essere memorizzato utilizzando questo metodo, e non c’è nessun bisogno di congelarli a-20 ° C o da-80 ° C immediatamente dopo la raccolta del sangue. DBS/DSS può rimanere a temperatura ambiente fino a 14 gi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
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