Tørket blod og Serum flekker som et nyttig verktøy for eksempel Storage evaluere kreft Biomarkers
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og nyttig metode for å lagre perifert blod og serum/plasma for nedstrøms analyser som single nukleotid polymorfisme (SNP) evaluering og ELISA-analysen.
Abstract
Blod prøve kvalitet er avgjørende for å sikre nøyaktig nedstrøms analyser som sanntid PCR eller ELISA. Riktig lagring av biologisk materiale er utgangspunktet oppnå reproduserbare og pålitelige resultater. Alle prøvene skal behandles på samme måte fra blod samling til lagring. Avhengig av analyser utføres, bør fullblod og serumprøver lagres på 20 ° C eller-80 ° C før bruk. Blod/serumprøver bør også være aliquoted å unngå flere fryse-tining. En annen viktig sak er eksempel betingelsene under forsendelsen fra ett laboratorium til en annen. Hvis tørris er ikke tilgjengelig eller forsendelsen tar lengre tid enn noen dager, er alternative tilnærminger nødvendig. Ett alternativ er å bruke filter papir for blod samling. Her foreslår vi en metode for blod og serum prøvetakingen som utnytter tørket blod flekker (DBS) og tørket serum flekker (DSS). Vi utviklet prosedyren for å trekke ut DNA fra DBS for nedstrøms evalueringen noen single nukleotid (SNPer) av sanntid PCR. Vi har også optimalisert ELISA analysen fra proteiner elut fra DSS. Denne metoden kan brukes med andre ELISA analyser eller prosedyrer evaluere proteiner.
Introduction
Hovedformålet med forskning i kreft biomarkers er identifisering av nye biologiske parametere som kan brukes for diagnostisering for forutsi pasienten prognose og for å avgjøre om en pasient vil svare på en behandling. Denne forskningen er grunnleggende for å nyskapende kreft behandlinger og spiller en nøkkelrolle i skreddersydd behandling.
Prosedyrene utført på hvert trinn i biomarkør identifikasjon og godkjenningen må være pålitelig og reproduserbar. En hjørnestein for suksessen av translasjonsforskning er riktig lagring av biologiske prøver som blod og serum. Dette er første skritt mot å få høy kvalitet biologisk materiale som kan brukes til å utføre molekylærbiologi eksperimenter eller protein analyser.
Multicenter studier er ofte nødvendig å rekruttere nok pasienter for å få sikre data. Ikke alle institutter kan lagre prøver-80 ° c eller sende prøver til andre internasjonale sentre i tørris. Bruk av filter papir for blod samling er en enkel metode for lagring av blod og serum og krever umiddelbar frysing av prøver1,2. En dråpe blod- eller serumprøver kan bli sett på papiret, igjen til tørr overnatting og lagres i opptil 14 dager ved romtemperatur1,2. Dette gir forskere tid å sende prøvene til andre laboratorier. Bruk av tørket blod flekker (DBS) og tørket serum flekker (DSS) kan dermed forenkle samarbeidet mellom institutter i industriland og utviklingsland.
Gitt sin brukervennlighet, er DBS prøvetaking mye brukt i flere typer analyser for serologisk eller genetisk nedstrøms analyser. For eksempel tidligere ble DBS ofte brukt for HIV screening i utviklingsland,1,,2,,3,,4,,5. En annen fordel med denne lagringsmetode er at blodprøver kan hentes fra finger-brodden, dermed muliggjør bruken for nyfødt screening tester 6,7,8. Enkelt eksempel håndtering og transport er ytterligere fordeler av DBS, spesielt for prøver i eksterne nettsteder der det er ingen laboratorieutstyr. I en tidligere publikasjon brukte vi DBS og DSS teste vitamin D og vitamin D bindende protein (DBP) i en rekke kaukasiske og afrikanske pasienter9. Våre afrikanske kolleger kunne ikke hente tørris. For å sammenligne den biologiske markører for å forstå forskjellene i vitamin D veien mellom de to etniske befolkningene, forbedret vi ytterligere prosedyren matchet utvalg lagret under standard betingelser og på filter papir. Etter optimalisere DBS/DSS prosedyren, kunne vi analysere DBP og vitamin D i pasienten serum i begge kohorter. Vi har også vurdert en rekke single nukleotid (SNPer) etter DNA utvinning fra fullblod for hvite og DBS for afrikanere9. Nåværende protokollen tillater høykvalitets blodprøver lagres ved romtemperatur uten å påvirke ulike typer nedstrøms analyser mellom molekylærbiologi ELISA analyser. Det anbefales for bruk til å styre biologisk materiale i multicenter studier eller sentre som ikke har fasiliteter for standard lagringsforhold. Følgende protokollen representerer kulminasjonen av disse optimalisert prosedyrer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen undersøker muligheten for lagring av blod og serum på filter papir når labs ikke har ansatte eller infrastruktur nødvendig for riktig håndtering av blodprøver. Spesielt fullblod eller serum samlet i standard rør eller finger-stikk kan lagres ved hjelp av denne metoden og det er ikke nødvendig å fryse samples ved 20 ° C eller-80 ° C umiddelbart etter samlingen blod. DBS/DSS kan forbli i romtemperatur i opptil 14 dager uten endring i blodårene/integritet. Viktig for lagring er tilstedeværelse…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Gráinne Tierney for redaksjonell bistand.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
