Secado de la sangre y manchas de suero como una herramienta útil para el almacenamiento de la muestra a evaluar biomarcadores de cáncer
Summary
Este protocolo describe un método sencillo y útil para almacenar sangre periférica y suero o plasma para análisis de aguas abajo como evaluación de un solo nucleótido polimorfismo (SNP) y el ensayo ELISA.
Abstract
Calidad de la muestra de sangre es crucial para asegurar el exactos análisis aguas abajo como en tiempo real PCR o ELISA. Almacenamiento correcto de materiales biológicos es el punto de partida para lograr resultados reproducibles y confiables. Todas las muestras deben ser tratadas de la misma forma de colección de sangre para almacenamiento. Dependiendo de los análisis a realizar, muestras de suero y sangre entera deben almacenarse a-20 ° C o -80 ° C hasta su uso. Las muestras de suero de sangre deben ser también alícuotas para evitar múltiples hielo-deshielo. Otra cuestión importante es las condiciones de la muestra durante el transporte de un laboratorio a otro. Si no hay hielo seco o el envío tarda más de unos días, se necesitan enfoques alternativos. Una opción es utilizar papel de filtro para recolección de sangre. Aquí, proponemos un método para la sangre y toma de muestras de suero que se aprovecha de secado manchas de sangre (DBS) y secado manchas de suero (DSS). Desarrollamos el procedimiento para extraer ADN de DBS para la posterior evaluación de algunos polimorfismos de nucleótido único (SNPs) por PCR en tiempo real. También hemos optimizado un ensayo de ELISA a partir de proteínas eluidas de DSS. Este método puede utilizarse con otros ensayos de ELISA o procedimientos de evaluación de las proteínas.
Introduction
El principal objetivo de la investigación en biomarcadores del cáncer es la identificación de nuevos parámetros biológicos que pueden utilizarse para el diagnóstico, de predicción de pronóstico paciente y para determinar si un paciente responderá a un tratamiento específico. Esta área de investigación es fundamental para el descubrimiento de tratamientos innovadores contra el cáncer y desempeña un papel clave en el tratamiento a medida.
Los procedimientos llevados a cabo durante cada paso de la identificación de biomarcadores y la validación deben ser fiables y reproducibles. Una piedra angular para el éxito de la investigación traslacional es el correcto almacenamiento de muestras biológicas tales como sangre y suero. Este es el primer paso hacia la obtención de material biológico de alta calidad que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de biología molecular o el análisis de proteínas.
A menudo se necesitan estudios multicéntricos reclutar suficientes pacientes para obtener datos robustos. No todos los institutos son capaces de almacenar las muestras a-80 ° C o enviar muestras a otros centros internacionales en hielo seco. El uso de papel de filtro para recolección de sangre es un método simple para el almacenamiento de sangre y suero y no requiere la congelación inmediata de las muestras1,2. Una gota de sangre o suero puede ser identificada en el papel, deja que seque durante la noche y entonces almacenar por hasta 14 días a temperatura ambiente1,2. Esto le da a los investigadores tiempo para enviar las muestras a otros laboratorios. El uso de sangre seca manchas (DBS) y manchas de suero seco (DSS) así podrían simplificar la colaboración entre los institutos en los países desarrollados y en vías de desarrollo.
Dada su facilidad de uso, muestreo de DBS es ampliamente utilizado en varios tipos de análisis genéticos o serológicos análisis aguas abajo. Por ejemplo, en el pasado, DBS se utiliza con frecuencia para el VIH en los países en desarrollo1,2,3,4,5. Otra ventaja de este método de almacenamiento es que se pueden recoger muestras de sangre del dedo-pinchazos, lo que permite su uso para recién nacidos cribado pruebas 6,7,8. Muestra fácil manipulación y el transporte son otras ventajas de DBS, especialmente para las muestras recogidas en sitios remotos donde no hay ningún equipo de laboratorio. En una publicación anterior, utilizamos DBS y DSS para probar la vitamina D y proteína de unión a vitamina D (DBP) en una serie de pacientes caucásicos y africanos9. Nuestros colegas africanos no fueron capaces de obtener hielo seco. Para comparar los marcadores biológicos para entender las diferencias en el camino de vitamina D entre las dos poblaciones étnicas, hemos mejorado el procedimiento de emparejado muestras almacenadas bajo condiciones estándar y en papel de filtro. Después de optimizar el procedimiento DBS/DSS, hemos podido analizar el DBP y la vitamina D en suero del paciente en ambas cohortes. También se evaluó una serie de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) después de la extracción de ADN de sangre para los caucásicos y de DBS para los africanos9. El presente Protocolo permite las muestras de sangre de alta calidad para ser almacenado a temperatura ambiente sin que afecten a diferentes tipos de análisis aguas abajo desde biología molecular hasta los ensayos ELISA. Se recomienda administrar materiales biológicos en estudios multicéntricos o centros que no disponen de instalaciones para las condiciones de almacenamiento estándar. El siguiente protocolo representa la culminación de estos procedimientos optimizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo investiga el potencial de almacenamiento de sangre y suero en papel filtro cuando los laboratorios no tienen el personal o las infraestructuras necesarias para el correcto manejo de las muestras de sangre. En particular, sangre entera o suero recogido en tubos estándar o por pinchazo de dedo puede almacenarse usando este método y no es necesario congelar las muestras a-20 ° C o -80 ° C inmediatamente después de la recolección de sangre. DBS/DSS puede permanecer a temperatura ambiente hasta por 14 dí…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Gráinne Tierney por asistencia editorial.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
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