Torkat blod och Serum ställen som ett användbart verktyg att utvärdera Cancer biomarkörer lagring på prov
Summary
Det här protokollet beskriver en enkel och användbar metod för att lagra perifert blod och serum/plasma för nedströms analyser såsom single nucleotide polymorphism (SNP) utvärdering och ELISA-testet.
Abstract
Blod prov kvalitet är avgörande för att säkerställa korrekt nedströms analyser såsom realtids PCR eller ELISA. Rätt lagring av biologiska material är utgångspunkten att uppnå reproducerbara och pålitliga resultat. Alla prover bör behandlas på samma sätt från blodinsamling till lagring. Beroende på analyserna som skall utföras, ska helblod och serumprover förvaras vid-20 ° C eller -80 ° C fram till användning. Blod-och/eller serumprov bör också aliquoted att undvika flera frysa-upptining. En annan viktig fråga är villkor som prov under transport från ett laboratorium till ett annat. Om torr-is är inte tillgänglig eller leveransen tar längre än några dagar, behövs alternativa metoder. Ett alternativ är att använda filterpapper för blodinsamling. Här föreslår vi en metod för blod och serum provsamling som utnyttjar blod fläckar (DBS) har torkats och serum ställen (DSS). Vi utvecklat förfarandet för att extrahera DNA från DBS för den efterföljande utvärderingen av vissa enda nukleotid polymorfismer (SNP) av realtid PCR. Vi har också optimerat ett ELISA test start från proteiner elueras från DSS. Denna metod kan användas med andra ELISA-analyser eller förfaranden utvärdera proteiner.
Introduction
Det främsta syftet med forskningen i cancer biomarkörer är identifiering av nya biologiska parametrar som kan användas för diagnos, för att förutse patientens prognos och för att fastställa om en patient kommer att svara på en specifik behandling. Detta forskningsområde är grundläggande för upptäckten av innovativa cancerbehandlingar och spelar en nyckelroll i skräddarsydd behandling.
De förfaranden som utförs under varje steg av biomarkör identifiering och validering måste vara tillförlitliga och reproducerbara. En hörnsten för att lyckas med translationell forskning är rätt lagring av biologiska prover såsom blod och serum. Detta är det första steget mot att få hög kvalitet biologiskt material som kan användas för att utföra molekylärbiologiska experiment eller protein assays.
Multicenterstudier krävs ofta att rekrytera tillräckligt många patienter för att få tillförlitliga data. Inte alla institut har möjlighet att lagra prover vid-80 ° C eller för att skicka prover till andra internationella centra i torr-is. Användning av filterpapper för blodtappning är en enkel metod för att lagra blod och serum och kräver inte omedelbar frysning av prov1,2. En droppe blod eller serum kan upptäckas på papperet, kvar att torka över natten och sedan lagras i upp till 14 dagar vid rumstemperatur1,2. Detta ger forskare tid att skicka proverna till andra laboratorier. Användning av torkat blod fläckar (DBS) och torkade serum ställen (DSS) kunde alltså förenkla samarbetet mellan institut i utvecklade länder och utvecklingsländer.
Med tanke på dess användarvänlighet, DBS stickprov används ofta i flera typer av analyser för serologiska eller genetiska nedströms analyser. Till exempel i förflutnan användes DBS ofta för HIV screening i utvecklingsländerna1,2,3,4,5. En annan fördel med denna lagringsmetod är att blodprov kan hämtas från finger-idioter, vilket möjliggör dess användning för nyfödda screening test 6,7,8. Lätt provhantering och transport är ytterligare fördelar med DBS, särskilt för prov som samlats i avlägsna platser där det finns ingen laboratorieutrustning. I en tidigare publikation använde vi DBS och DSS för att testa D-vitamin och vitamin D-bindande protein (DBP) i en serie av kaukasiska och afrikanska patienter9. Våra afrikanska kolleger kunde inte få torr-is. För att jämföra de biologiska markörerna för att förstå skillnaderna i vitamin D väg mellan de två etniska populationerna, förbättrat vi ytterligare proceduren med matchade prover lagras under standart villkorar och på filterpapper. Efter optimering förfarandet DBS/DSS, kunde vi analysera DBP och D-vitamin i patientens serum i båda kohorterna. Vi har också utvärderat ett antal enda nukleotid polymorfismer (SNP) efter DNA-extraktion från helblod kaukasier och DBS för afrikaner9. Detta protokoll tillåter hög kvalitet blodprov för att lagras i rumstemperatur utan att det påverkar olika typer av nedströms analyser allt från molekylärbiologi till ELISA-analyser. Det rekommenderas att hantera biologiskt material i multicenterstudier eller centra som inte har faciliteter för standard förvaringsanvisningar. Följande protokoll representerar kulmen av procedurerna optimerad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll undersöker potentialen för att lagra blod och serum på filterpapper när labben inte har personal eller infrastruktur som behövs för korrekt hantering av blodprover. Särskilt, helblod eller serum som tas ut i standard rör eller genom finger-prick kan lagras med den här metoden och det finns ingen anledning att frysa prover vid-20 ° C eller -80 ° C omedelbart efter samlingen blod. DBS/DSS kan förbli vid rumstemperatur i upp till 14 dagar utan någon förändring i blod/serum integritet. En kriti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Gráinne Tierney för redaktionellt stöd.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
