Getrocknete Blut und Serum Spots als ein nützliches Werkzeug für die Lagerung der Probe, Cancer Biomarkers zu bewerten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und nützliche Methode zum Speichern von peripherem Blut und Serum/Plasma für nachgelagerte Analysen wie Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP) Bewertung und ELISA-Assay.
Abstract
Blut-Sample-Qualität ist entscheidend für genaue nachgeschalteten Analysen wie Real-Time PCR und ELISA zu gewährleisten. Richtige Lagerung von biologischen Materialien ist der Ausgangspunkt, reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Alle Proben sollten auf die gleiche Weise von Blutentnahme zur Lagerung behandelt werden. Je nach den Analysen durchgeführt werden sollten Vollblut und Serumproben bis zur Verwendung bei-20 ° C oder-80 ° C gelagert werden. Blut/Serum Proben sollte auch regelmäñig, mehrere Einfrieren Auftauen zu vermeiden. Ein weiteres wichtiges Thema ist die Probe Bedingungen während des Transportes von einem Labor zum anderen. Trockeneis ist nicht verfügbar, oder die Sendung dauert länger als ein paar Tage, sind alternative Ansätze erforderlich. Eine Option ist, Filterpapier für die Blutentnahme zu verwenden. Hier schlagen wir eine Methode für Blut und Serum-Sample-Sammlung, die nutzt getrocknete Blutflecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS). Wir entwickelten das Verfahren, um durch Real-Time PCR DNA von DBS für die nachgelagerten Bewertung der einige Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) zu extrahieren. Wir haben auch einen ELISA-Test ab Proteine eluiert von DSS optimiert. Diese Methode kann mit anderen ELISA-Assays oder Verfahren, die Bewertung von Proteinen verwendet werden.
Introduction
Das Hauptziel der Forschung in Krebs-Biomarker ist die Identifizierung neuer biologischer Parameter, die verwendet werden können, für die Diagnose und für Vorhersage Prognose der Patienten, für die Bestimmung, ob ein Patient auf eine bestimmte Behandlung ansprechen wird. Dieses Forschungsgebiet ist von grundlegender Bedeutung für die Entdeckung des innovativen Krebstherapien und spielt eine Schlüsselrolle in maßgeschneiderte Behandlung.
Bei jedem Schritt der Biomarker-Identifizierung und Validierung durchgeführten Verfahren müssen zuverlässig und reproduzierbar sein. Ein Eckpfeiler für den Erfolg der translationalen Forschung ist die korrekte Lagerung von biologischen Proben wie Blut und Serum. Dies ist der erste Schritt zur Gewinnung qualitativ hochwertige biologische Material, das verwendet werden kann, molekularbiologische Experimente oder Protein-Tests durchführen.
Multizentrische Studien sind oft erforderlich, um genügend Patienten um aussagekräftige Daten zu erhalten. Nicht alle Institute sind in der Lage, Proben bei-80 ° C zu speichern oder Proben zu anderen internationalen Zentren in Trockeneis zu senden. Die Verwendung von Filterpapier für die Blutentnahme ist eine einfache Methode zum Speichern von Blut und Serum und erfordert keine sofortige Einfrieren der Proben1,2. Ein Tropfen Blut oder Serum kann auf das Papier, verließ über Nacht trocknen und dann für bis zu 14 Tage bei Raumtemperatur1,2gespeichert gesichtet werden. So haben Forscher Zeit senden Sie die Proben an andere Laboratorien. Die Verwendung von getrocknetem Blut Flecken (DBS) und getrocknete Serum Flecken (DSS) könnte so vereinfachen Sie die Zusammenarbeit zwischen den Instituten in Industrie-und Entwicklungsländern.
Aufgrund seiner einfachen Handhabung, ist DBS Stichproben in verschiedenen Arten von Tests für serologische oder genetische nachgeschalteten Analysen weit verbreitet. Beispielsweise wurden in der Vergangenheit häufig DBS HIV-screening in Entwicklungsländern1,2,3,4,5verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Speichermethode ist, dass Finger-Schwänze, so dass seine Verwendung für Neugeborenen-screening Tests 6,7,8Blutproben entnommen werden können. Einfach Probe Handhabung und Transport sind weitere Vorteile des DBS, vor allem für Proben an remote-Standorten wo gibt es keine Laborgeräte. In einer früheren Publikation verwendeten wir DBS und DSS, um Vitamin D und Vitamin-D-bindendes Protein (DBP) in einer Reihe von kaukasischen und afrikanischen Patienten9zu testen. Unsere afrikanischen Kollegen konnten nicht Trockeneis zu erhalten. Um die biologische Marker zum Verständnis der Unterschiede in der Vitamin-D-Weg zwischen den zwei ethnischen Bevölkerungen zu vergleichen, haben wir das Verfahren mit übereinstimmenden Muster gespeichert unter Standardbedingungen und auf Filterpapier weiter optimiert. Nach der Optimierung des DBS/DSS-Verfahrens, konnten wir DBP und Vitamin D im Patientenserum in beiden Kohorten analysieren. Wir haben auch eine Reihe von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) nach der Extraktion der DNA aus Vollblut für Kaukasier und DBS für Afrikaner9. Dieses Protokoll ermöglicht qualitativ hochwertige Blutproben bei Raumtemperatur gelagert werden, ohne die verschiedenen Arten der nachgeschalteten Analysen von Molekularbiologie bis hin zu ELISA-Assays. Es wird empfohlen für den Einsatz an biologischen Materialien in multizentrischen Studien verwalten oder für die Zentren, die nicht über Einrichtungen für standard Lagerbedingungen. Das folgende Protokoll stellt den Höhepunkt dieser optimierten Verfahren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll untersucht das Potential für die Lagerung von Blut und Serum auf Filterpapier bei die Übungseinheiten keine Mitarbeiter oder Infrastrukturen benötigt für die korrekte Handhabung von Blutproben haben. Vor allem Vollblut oder Serum gesammelt in standard Röhren oder per Finger-stechen kann mit dieser Methode gespeichert werden und gibt es keine Notwendigkeit, sofort nach der Blutentnahme Proben bei-20 ° C oder-80 ° C eingefroren. DBS/DSS können bei Raumtemperatur bis zu 14 Tage lang ohne jede Änder…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Gráinne Tierney für redaktionelle Unterstützung bedanken.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
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