Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels
Summary
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.
Abstract
L’analyse des composants bioactifs présents dans les aliments et produits naturels est devenu un quartier populaire d’étude dans de nombreux domaines, y compris traditionnelle sécurité/toxicologie chinoise médecine et de la nourriture. Plusieurs des techniques classiques d’analyse nécessitent des équipements coûteux ou des compétences. Notamment, les dosages immuno-enzymatiques (Elisa) sont devenus une méthode nouvelle pour l’analyse des aliments et des produits naturels. Cette méthode est basée sur médiée par les anticorps de détection des composants cible. Cependant, comme de nombreux éléments bioactifs dans les produits naturels sont de petite taille (< 1 000 Da) et ne pas provoquer une réponse immunitaire, la création d’anticorps monoclonaux (ACM) contre eux est souvent difficile. Dans ce protocole, nous fournir une explication détaillée des étapes requises pour générer des ACM contre les molécules cibles ainsi que celles nécessaires pour créer les associés indirects concurrentiel (ic) ELISA pour l’analyse rapide de ce composé dans des échantillons multiples. La procédure décrit la synthèse de l’antigène artificiel (c.-à-d., le conjugué de l’Haptène-carrier), fusion cellulaire, vaccination, préparation d’hybridome monoclonale, caractérisation du Lam et l’application par ELISA de la mAb. Le conjugué de l’Haptène-carrier a été synthétisé par le sodium periodate méthode et évaluées par MALDI-TOF-MS. Après l’immunisation, les splénocytes ont été isolés chez la souris immunisée avec le titre d’anticorps plus élevé et fusionné avec l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) – lignée de cellules d’un myélome de souris sensibles Sp2/0 – Ag14 utilisant un polyéthylène glycol (PEG)-méthode de base. Les hybridomes sécrétant mAbs réagissant à l’antigène cible ont été criblés par icELISA de spécificité et de la réactivité croisée. En outre, la méthode de dilution limite a été appliquée pour préparer les hybridomes monoclonales. Le mAbs final ont été davantage caractérisé par icELISA et ensuite utilisé dans une application par ELISA pour la détection rapide et commode de l’Haptène exemple (naringine (NAR)) en produits naturels.
Introduction
Anticorps monoclonaux (ACM), également connu sous le nom des anticorps mono spécifiques, sont produites à partir d’un seul clone de lymphocyte et sont composés d’anticorps monovalents que tous se lient au même épitope1. Ces dernières années, de nombreux produits naturels provenant de plantes médicinales ont été utilisés dans le traitement de diverses maladies2. En effet, les nombreux petits composés moléculaires initialement dérivés de produits naturels sont maintenant appliquées comme des médicaments de première ligne, tels que de l’artémisinine pour le paludisme et paciltaxel (taxol) pour cancer2,3. L’étude des produits naturels a rapidement progressé, en grande partie en raison de l’énorme développement et l’optimisation des techniques d’analyse classiques, y compris la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse (MS). Cependant, il y a encore quelques limitations associées à ces méthodes, telles que leurs protocoles complexes de prétraitement et les coûts connexes en ce qui concerne le temps, du travail et des compétences et instruments requis4.
Récemment, les analyses axées sur le mAb immuno-enzymatique (Elisa) ont été appliquées pour analyser qualitativement et quantitativement les aliments et produits naturels. En fait, cette méthode a été appliquée pour l’analyse des échantillons biologiques et des tests cliniques et a été montrée pour être précise, sensible et hautement efficace tout en évitant aussi les étapes de prétraitement fastidieux associés à d’autres analyses5, 6.
Lors de l’utilisation de tests Elisa axée sur le mAb pour étudier les produits naturels complexes, préparation des anticorps monoclonaux est une des étapes essentielles. Malheureusement, le mAbs spécifiques aux petits composants bioactifs présents dans ces types de substances6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sont souvent limitées par rapport aux antigènes protéiques. Pour contourner ce problème, nous avons développé un protocole pour générer précisément mAbs contre petits composés. Le protocole présenté ici comprend la synthèse de l’antigène artificiel, immunisation de souris, fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte et la préparation de l’hybridome monoclonale.
Notamment, notre groupe de recherche a été étudier la formation du mAbs contre petits composés bioactifs des médecines traditionnelles chinoises et développer leurs applications pour des années. Dans nos études en cours, nous avons développé des ACM contre baicaline16, puerarin17, acide glycyrrhizique18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121et beaucoup d’autres petites molécules. Nos protocoles d’ELISA basés sur ces mAbs ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour évaluer les propriétés pharmacocinétiques de ces petites molécules ainsi que leurs interactions avec d’autres composés bioactifs. En outre, à l’aide de ces ACM, nous avons également développé méthodes de chromatographie d’immunoaffinité pour la séparation des analogues structuraux, y compris les épimères. Récemment, nous avons préparé un immunoessai écoulement latéral à l’aide de notre mAb anti-puerarin qui a ensuite été utilisé pour la détection rapide, sur place de ce composé. Nos résultats indiquent que nos analyses mAb sont des outils indispensables et commodes pour l’étude de la biologie et la qualité de composés dérivés du naturel-produit, en particulier celles utilisées dans les médecines traditionnelles chinoises.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un protocole pour le succès de la production du mAbs contre naturels produit dérivé de petites molécules. Les étapes essentielles de la procédure ont été exposées, et nous avons démontré l’utilité du présent protocole à l’aide de NAR comme une petite molécule d’exemple. Les spectres de l’exemple, les analyses de réactivité et icELISA résultats tous montrent représentant expérimental et les données de contrôle qui sont obtenues à l’aide de ce protocole. Images d’exem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de sciences naturelles de Chine (subvention numéros 81573573, 81473338 et 81503344) et le classique Prescription base équipe de recherche à l’Université de Pékin de médecine chinoise.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
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