דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים
Summary
מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.
Abstract
הניתוח של הרכיבים ביואקטיביות נוכח מזונות ומוצרים טבעיים הפך אזור פופולרי של המחקר בתחומים רבים, לרבות מסורתית סינית רפואה ומזון בטיחות/רעלים. רבים של טכניקות ניתוח קלאסי דורשים ציוד יקר ו/או התמחות. ראוי לציין, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הפכו שיטה המתעוררים לניתוח של מזונות ומוצרים טבעיים. שיטה זו מבוססת על זיהוי בתיווך נוגדנים של רכיבי היעד. עם זאת, רבים רכיבים ביו-אקטיביים במוצרים טבעיים הם קטנים (< 1,000 Da), אל תגרום / תגובה חיסונית, יצירת נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) נגדם הוא לעתים קרובות קשה. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים הסבר מפורט של כל השלבים הדרושים להפקת mAbs נגד היעד מולקולות, כמו גם אלה צריך ליצור את המשויך עקיף תחרותי (ic) אליסה לניתוח מהיר של המתחם בדגימות מרובות. ההליך מתאר את סינתזה של אנטיגן מלאכותיים (קרי, המספר המשלים הפטן-המוביל), חיסונים, פיוז’ן תא, ליפידים monoclonal הכנה, אפיון mAb ולאחר יישום מבוסס-אליסה של mAb. המספר המשלים הפטן-המוביל היה מסונתז על ידי הנתרן periodate שיטת ומוערכת על ידי MALDI-תוף-MS. לאחר חיסון, splenocytes הם בודדו אותנו מהמתרחש העכבר immunized עם כייל נוגדנים הגבוהה, התמזגו עם Ag14 (כובע) – העכבר רגיש מיאלומה תא קו Sp2/0 – hypoxanthine-aminopterin-תימידין באמצעות של פוליאתילן גליקול (PEG)-המבוסס על שיטה. Hybridomas הפרשת mAbs תגובתי ל אנטיגן מטרה הוקרנו על-ידי icELISA ירידה לפרטים, אשיג. יתר על כן, שיטת הדילול המגביל הונחה להכין monoclonal hybridomas. MAbs הסופית היו עוד יותר מאופיין icELISA, ואז מנוצל יישום המבוסס על אליסה איתור מהיר ונוח הפטן דוגמה (naringin (NAR)) במוצרים טבעיים.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), הידוע גם בשם נוגדנים ספציפיים מונו, מיוצרים שיבוט B-lymphocyte יחיד, המורכבת של נוגדנים monovalent כל לאגד epitope אותה1. בשנים האחרונות, מרפא הצמחי הטבעי מוצרים רבים שימשו לטיפול במחלות שונות2. ואכן, רבים תרכובות מולקולריות קטנות נגזר במקור מוצרים טבעיים המוחלות כעת כמו תרופות שורה ראשונה, כגון ארטמיסינין עבור מלריה ו- paciltaxel (טקסול) עבור סרטן2,3. המחקר של מוצרים טבעיים עשה התקדמות מהירה, בעיקר בשל פיתוח אדירה, אופטימיזציה של טכניקות ניתוח קונבנציונלי, כולל ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) וספקטרומטר מסה (MS). עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות הקשורות בשיטות אלה, כגון פרוטוקולים pretreatment מורכבים שלהם ואת עלויות לגבי זמן העבודה/מומחיות, כלים נדרשים4.
לאחרונה, מבחני מבוססי mAb מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הוחלו לנתח איכותית, באופן כמותי מזון ומוצרים טבעיים. למעשה, שיטה זו הוחל עבור ניתוח דגימות ביולוגיות והן ניסויים קליניים, הוכח להיות מדויק, רגיש ויעיל מאוד תוך הימנעות גם את השלבים pretreatment מייגע המשויך ניתוחים אחרים5, 6.
בעת שימוש ELISAs מבוססי mAb ללמוד מורכבים מוצרים טבעיים, הכנת נוגדנים חד-שבטיים הוא אחד הצעדים הליבה. למרבה הצער, mAbs מסוימים ברכיבים ביו קטן נוכח סוגים אלה של חומרים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 מוגבלים לעיתים קרובות לעומת חלבון אנטיגנים. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו פרוטוקול ליצירת mAbs נגד תרכובות קטן במיוחד. פרוטוקול המוצג כאן כולל סינתזה מלאכותית אנטיגן, חיסון עכבר, פיוז’ן תא, עקיף ELISA תחרותי ליפידים monoclonal הכנה.
ראוי לציין, קבוצת המחקר שלנו יש כבר לומד היווצרות של mAbs נגד תרכובות ביו קטנה של תרופות סיניות מסורתיות, פיתוח היישומים שלהם במשך שנים. במחקרים שלנו מתמשך, פיתחנו mAbs נגד baicalin16, puerarin17,18, חומצה glycyrrhizic, paeoniflorin19, Re ginsenoside20, ginsenoside Rh121, הרבה מולקולות קטנות אחרות. פרוטוקולים אליסה שלנו המבוססת על mAbs אלה שימשו מספר מחקרים כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של מולקולות קטנות אלה, כמו גם הגומלין שלהם עם אחרים תרכובות ביו. יתר על כן, באמצעות mAbs האלה, גם פותחו שיטות כרומטוגרפיה immunoaffinity ההפרדה של מבנים מקבילים, כולל epimers. לאחרונה, הכנו של ראגנטים לרוחב זרימה באמצעות שלנו mAb anti-puerarin ששימש לאחר מכן לצורך זיהוי מהיר, באתר של מתחם זה. התוצאות שלנו מציינים כי מבחני מבוססי mAb שלנו הם כלי חיוני, נוח ללמוד את הביולוגיה ואיכות טבעי-מוצר-derived תרכובות, במיוחד אלה בשימוש תרופות סיניות מסורתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מוצלחת של mAbs נגד מולקולות קטנות נגזר מוצר טבעי. השלבים החיוניים במסגרת ההליך יש כבר המתוארים, הראו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות נאר כמו מולקולה קטנה דוגמה. דוגמה ספקטרה, תגובתיות ניתוחים ותוצאות icELISA שלהציג את כל נציג ניסיוני ונתונים שליטה שהושגו באמצעו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן סין (גרנט מספרים 81573573, 81473338 ו- 81503344), קלאסית מרשם בסיסי צוות המחקר באוניברסיטת בייג’ינג ברפואה הסינית.
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
