天然物に対するモノクローナル抗体の作製
Summary
準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA 解析を使用して抗体の特性の仕様もあります。
Abstract
食品や天然物の生理活性成分の分析は、伝統的な中国医学や食品安全/毒物学を含む多くの分野で研究の人気のエリアになっています。古典的な分析の技術の多くは高価な機器や専門知識を必要とします。特に、酵素抗体法 (Elisa) 食品や天然物の分析のための新たな方法となっています。このメソッドは、ターゲット コンポーネントの抗体検出に基づいています。しかし、天然の生理活性成分の多くが小さい (< 1,000 Da) と免疫反応を誘発しない、それらに対するモノクローナル抗体 (Mab) を作成するは困難です。このプロトコルでは、複数のサンプルの化合物の迅速分析に関連する間接競争 (ic) ELISA を作成に必要なものだけでなく、標的分子に対する抗体を生成するために必要な手順の詳細な説明を提供します。手順では、(すなわち、ハプテン キャリア共役) 人工抗原の合成、免疫、細胞融合、モノクローナルハイブリドーマ準備、モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションと mAb の elisa 法を用いたアプリケーションについて説明します。ハプテン キャリア共役はナトリウムによって合成されたメソッドを過ヨウ素酸し、MALDI TOF MS によって評価されます。予防接種後脾細胞が最も高い抗体価と免疫マウスから分離したし、ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) – 敏感なマウス骨髄腫細胞ライン Sp2/0 – Ag14 と融合、ポリエチレング リコール (PEG) を使用しての手法します。ターゲット抗原に対する反応性抗体産生ハイブリドーマの特異性と交差反応性の icELISA で上映されました。さらに、限界希釈法は、モノクローナル ハイブリドーマの準備に適用されました。最終的な Mab icELISA によってさらに特徴づけられる、天然の例ハプテン (ナリンギン (NAR)) の迅速で簡便な検出のための elisa 法を用いたアプリケーションのために用いられる。
Introduction
モノクローナル抗体 (Mab)、として知られているモノラル特異的抗体、単一 b リンパ球クローンから生成され、すべてが同じエピトープ1にバインドすると 1 価の抗体で構成されています。近年、多く薬用植物由来の天然物は、様々 な病気の2の治療に使用されています。確かに、もともと天然物から派生した多くの小さな分子の化合物が癌2,3paciltaxel (タキソール) ・ マラリアのアルテミシニンなどの最初の行薬として適用されます。天然物の研究は主に途方もない開発と高速液体クロマトグラフィー (HPLC) や質量分析法 (MS) など、従来の解析手法の最適化のための急速な進歩をしました。ただし、まだ複雑な前処理プロトコルや時間、労働/専門知識、および必要な楽器4に関して関連するコストなど、これらの方法に関連付けられているいくつかの制限があります。
最近では、モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法 (Elisa) は、定性的・定量的分析食品や天然物に適用されています。実際には、このメソッドの生体試料分析と臨床検査の両方に適用されているし、も関連付けられているその他の解析5、面倒な前処理手順を回避しながら、正確、敏感、かつ高効率に示されています。 6。
モノクローナル抗体を用いた Elisa を使用して、複雑な天然物を研究する、モノクローナル抗体の調製は、主な手順の 1 つです。残念ながら、Mab は小さな生物活性成分物質6,7,8,9,10、11,12 のこれらのタイプの存在に固有 ,13,14,15蛋白質の抗原と比較して限られています。この問題を回避するためには、具体的には小さな化合物に対して抗体を生成するプロトコルを開発しました。ここで提示されたプロトコルには、人工抗原の合成には、マウス免疫には、細胞融合には、間接競合 ELISA にはモノクローナルハイブリドーマ準備が含まれます。
特に、我々 の研究グループは中国の伝統薬から小さな生理活性物質に対するモノクローナル抗体の形成を勉強と長年彼らのアプリケーションを開発されています。当社の継続的研究では、baicalin16、puerarin17グリチルリチン酸18、ペオニフロリン19、ジンセノ サイド Re20、ジンセノ サイド Rh121、および他の多くの小さい分子に対して抗体を開発しました。これらの Mab に基づいて私達の ELISA のプロトコルは、その他の生理活性物質との相互作用と同様に、これらの小さな分子の薬物動態を評価する多くの研究で使用されています。さらに、これらのモノクローナル抗体を使用して、構築した immunoaffinity クロマトグラフィー法黒淵を含む構造の類似物の分離。最近では、この化合物、敷地内に急速な検出のために使用されました私たちの抗 puerarin モノクローナル抗体を用いた側方流動免疫測定法をご用意しました。モノクローナル抗体アッセイが生物学と伝統的な中国薬で使用される特にそれら天然由来製品化合物の質を研究するための不可欠なツールであることが示唆されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、自然製品由来の低分子抗体の巧妙な生産のためのプロトコルを提案する.重要な手順が記載されているし、我々 は例小分子として NAR を使用してこのプロトコルの有用性を示しています。例スペクトル、反応性の解析と icELISA の結果は、代表実験と、このプロトコルを使用して取得コントロール データを表示します。ハイブリドーマの例の画像は、どのような研究者を探していな?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81573573、81473338、および 81503344) および古典的な処方基本的な研究チームが北京大学で中国医学のサポートだった。
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
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