Hier beschreiben wir chirurgische Verfahren zur Herstellung einer zuverlässigen Rückenmarks-Lateral-Hemisektion (HX) auf der9. Brustebene bei erwachsenen Ratten und neuroverhaltensbezogene Beurteilungen, die zum Nachweis asymmetrischer Defizite nach einer solchen einseitigen Verletzung entwickelt wurden.
Unvollständige Rückenmarksverletzungen (SCI) führen oft zu Beeinträchtigungen der sensorimotorischen Funktionen und ist klinisch die häufigste Art von SCI. Humanes Brown-Séquard-Syndrom ist eine häufige Art von unvollständigem SCI, der durch eine Läsion auf die eine Hälfte des Rückenmarks verursacht wird, was zu Lähmungen und dem Verlust der Propriozeption auf der gleichen (oder ipsilesionalen) Seite wie die Verletzung und verlustsverlust von Schmerzen und Temperaturgefühlen auf der gegenüberliegenden Seite (oder kontralierung) führt. Angemessene Methoden zur Herstellung einer lateralen Rückenmarks-Hemisektion (HX) und zur Beurteilung neurologischer Beeinträchtigungen sind unerlässlich, um ein zuverlässiges Tiermodell des Brown-Séquard-Syndroms zu etablieren. Obwohl das laterale Hemisektionsmodell eine zentrale Rolle in der Grundlagen- und Translationsforschung spielt, fehlen standardisierte Protokolle zur Erstellung einer solchen Halbsektion und zur Bewertung der unilateralisierten Funktion. Das Ziel dieser Studie ist es, Schritt-für-Schritt-Verfahren zu beschreiben, um eine Ratte Spinallaterale HX auf der9. Brust (T9) Wirbelebene zu produzieren. Wir beschreiben also eine kombinierte Verhaltensskala für HX (CBS-HX), die eine einfache und sensible Bewertung der asymmetrischen neurologischen Leistung für einseitige SCI bietet. Der CBS-HX, von 0 bis 18, besteht aus 4 Einzelbewertungen, die einseitiges Hinterstufenspringen (UHS), Kupplung, Kontaktplatzierung und Gitterwandern umfassen. Bei CBS-HX werden die ipsilateralen und kontralateralen Hinterbeine getrennt bewertet. Wir fanden heraus, dass nach einem T9 HX die ipsilaterale Hintergliedigkeit eine beeinträchtigte Verhaltensfunktion zeigte, während das kontralaterale Hinterglied eine erhebliche Erholung zeigte. Das CBS-HX diskriminierte effektiv Verhaltensfunktionen zwischen ipsilateralen und kontralateralen Hinterbleibs und erkannte das zeitliche Fortschreiten der Erholung des ipsilateralen Hinterglieds. Die CBS-HX-Komponenten können bei Bedarf separat oder in Kombination mit anderen Maßnahmen analysiert werden. Obwohl wir nur visuelle Beschreibungen der chirurgischen Verfahren und Verhaltensbeurteilungen eines thorakalen HX zur Verfügung gestellt haben, kann das Prinzip auf andere unvollständige GGIs und auf anderen Ebenen der Verletzung angewendet werden.
Die unvollständigen Rückenmarksverletzungen (SCI) führen oft zu schweren und anhaltenden Beeinträchtigungen der sensorimotorischen Funktionen und sind klinisch die häufigste Art von SCI1. Das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen wird durch eine Läsion auf die Hälfte des Rückenmarks verursacht, die zu Lähmungen und dem Verlust der Propriozeption auf der gleichen (oder ipsilesionalen) Seite wie die Verletzung und Verlust von Schmerzen und Temperaturempfindung auf der gegenüberliegenden (oder kontraproduktiven) Seite führt2,3,4. Spinale laterale Hämisektion Tiermodelle werden breit verwendet, um das menschliche Brown-Séquard-Syndrom zu imitieren und sie wurden bei Ratten5,6,7,,8,9, Opossums10, und Affen7,11,12,13 von verschiedenen Laboratorien auf verschiedenen Wirbelsäulenebenen berichtet. Detaillierte visualisierte Verfahren zur Herstellung einer standardlateralen Halbsektion wurden jedoch nicht beschrieben. Die Bereitstellung von Schritt-für-Schritt-Verfahren für eine laterale Halbsektion sollte das Modell optimieren und den Vergleich oder die Replikation experimenteller Ergebnisse in der Grundlagen- und Translationsforschung erleichtern.
Ein einseitiger SCI erzeugt asymmetrische und unverhältnismäßige Verhaltensdefizite, die mit herkömmlichen Bewertungen für symmetrische Verletzungen schwer messbar sind. Eine geeignete Methodik zur Bewertung neurologischer Beeinträchtigungen für ein einseitiges GGB ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung eines einseitigen SCI-Modells. Trotz der zentralen Rolle einer einseitigen Wirbelsäulenverletzung fehlen standardisierte Protokolle zur Bewertung sensorimotorischer Defizite bei Tieren mit einer solchen Verletzung. Die Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) Locomotor-Bewertungsskala war die am häufigsten verwendete Messung der Funktion nach SCI für erwachsene Ratten 14, was eine semiquantitative Beschreibung der Fortbewegung als Ganzes ergibt. Es misst jedoch nicht jedes Hinterglied unabhängig.
In dieser Studie berichten wir schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung eines Nagetier-Spinal-HX auf der9. Brust (T9) Wirbelebene. Wir führen auch eine kombinierte Verhaltensskala für die Hemisektion (CBS-HX) ein, die einseitiges Hinterstufentreten (UHS), Kopplung, Kontaktaufnahme und Grid Walking-Bewertungen zur Bewertung neurologischer Beeinträchtigungen und Erholung nach einem einseitigen SCI umfasst. Wir hoffen, dass dieses Modell ein nützliches Modell für die Untersuchung von Verletzungsmechanismen und therapeutischen Effizienzen für einseitige GKI sein wird.
In dieser Studie berichten wir schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung eines einfachen, konsistenten und reproduzierbaren T9-Spinal-HX bei erwachsenen Ratten, das das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen imitiert. Wir führen ferner ein kombiniertes Verhaltens-Score-System für die Hemisektion (CBS-HX) ein, das empfindlich ist, um asymmetrische neurologische Beeinträchtigungen und das Fortschreiten der Genesung zu bewerten, gemessen durch eine Kombination aus einseitigem Hinterbeinschritt (UHS), Kopplung (CPL), Platzierung kontakt, und Gitter gehen. Obwohl wir die Verletzung auf T9-Ebene nachweisen, kann dieses Verfahren auf andere Bereiche des Rückenmarks angewendet werden, einschließlich der Hals- und Lendenbänder auf einfache und anspruchslose Weise. Wir hoffen, dass dieses Modell zusammen mit einseitigen Verhaltensbeurteilungen nützlich sein wird, um Verletzungsmechanismen und therapeutische Wirksamkeiten für solche Arten von GGB zu untersuchen.
Da das seitliche HX-Modell nur die ipsilaterale Hälfte der Schnur lädiert, ist die kontralaterale Seite der Schnur weitgehend erhalten und kann als interne Kontrolle verwendet werden. Viele absteigende und aufsteigende Pfade werden einseitig projiziert, und eine seitliche Halbierung verursacht in vielen Fällen Schäden an einem Axontrakt auf der einen Seite und bewahrt den gleichen Trakt auf der gegenüberliegenden Seite, was einen Vergleich der Reorganisation und funktionelle Natoren dieser Trakte bei demselben Tier. Darüber hinaus kann die Erzeugung einer stärker lokalisierten Läsion die Ausrichtung bestimmter Pfade ermöglichen. Zum Beispiel kann eine ventrale und ventrolaterale Läsion die Retikulaspinal- und Vestibulospinalwege beeinflussen. Eine dorsale oder dorsolaterale Läsion kann die Kortikal- und Rubrospinalwege beeinflussen. Das Hemisektions- oder Teilverletzungsmodell kann auch verwendet werden, um die Anatomie und Funktion anderer Bahnen zu untersuchen, wie z. B. der propriospinale, noradrerge oder serotonerge Bahnen. So kann das Hemisektionsmodell eindeutig eingesetzt werden, um die Kompensation durch sensorische Afferents, durch absteigende Bahnen und durch intrinsische Wirbelsäulenkreisläufe zu untersuchen. Dieses Modell eignet sich auch zur Untersuchung von Mechanismen der Bewegungsrückgewinnung nach HX.
Das laterale HX führt zu offensichtlichen Verhaltensstörungen, die unter motorischen Aufgaben (z.B. Treadscan oder Laufband) Paradigma für die automatisierte Ganganalyse 19bewertet werden können. Auch die Leitfähigkeit der axonalen Trakte auf der kontralateralen Seite zur Läsion konnte mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen gemessen werden, und diese Auswertung bietet die Möglichkeit, eine funktionelle Reorganisation nach verschiedenen Behandlungen zu etablieren. Darüber hinaus ermöglichen einseitige Injektionen der anatomischen Tracer in Neuronen eines bestimmten Weges die Visualisierung von anterograd beschrifteten Mittellinien-Kreuzungsfasern und deren Verbindung mit retrograd markierten Neuronen20,21,22,23,24,25.
Obwohl eine typische Spinal-HX-Operation weniger als 20 Minuten dauert, erfordert es einige Praxis, um eine präzise und konsistente HX zu erreichen. Erstens ist es wichtig, dass der HX-Spiegel der Wirbelsäule von Tier zu Tier konsistent ist. Daher ist es entscheidend, dass das geeignete Wirbelsegment für die Laminektomie identifiziert wird. Stellen Sie zweitens sicher, dass der HX vollständig ist. Um ein komplettes HX zu erstellen, kann man eine 30-Spur-Nadel verwenden, die vertikal durch die Mittellinie eingeführt wird, um das Schneiden mit mikroscheren zu führen. Die Nadeleinfügung vermeidet auch Schäden an den hinteren Wirbelsäulengefäßen oder der Schnur über Läsionen. Die zweite Funktion der 30-Spur-Nadel ist, dass sie als Messer dienen kann, um den Schnitt zu verfolgen, um sicherzustellen, dass es keine Mehrdeutigkeit der Läsion gibt. Drittens kann das Platzieren von Gelatine auf der Läsionsstelle das Auslaufen der Zerebrospinalflüssigkeit minimieren, und das Platzieren des Zements auf der Gelatine und das Überbrücken der Wirbellamina kann die Stabilität der Wirbelsäule an der Läsionsstelle stärken und die Wundheilung erleichtern. Um die Signalstörungen bei der Anwendung elektrophysiologischer Aufnahmen zu vermeiden, sollten Muskeln, Faszien und Haut in Schichten mit 4-0 Seidenfaden vernässt werden. Schließlich sollten alle Anstrengungen unternommen werden, um die Schädigung des kontralateralen Rückenmarks zu minimieren. Es sollte eine histologische Überprüfung eingerichtet werden, um eine vollständige seitliche Halbsektion auf der einen Seite und die Erhaltung der anderen Hälfte der Schnur auf der anderen Seite zu bestätigen (siehe Abbildung 6E).
Um die Fortbewegung nach SCI zu verbessern, haben frühere Studien eine breite Palette von Strategien wie Zelltransplantation, Axonregeneration 8,,18,26,27und aktivitätsbasierte Rehabilitation 28,29,30verwendet. Inzwischen wurden mehrere Verhaltenstests für die funktionelle Bewertung und zum Screen enthebieren für die besten Behandlungen nach SCI etabliert. Die BBB-Bewegungsleitlinie wurde für die motorische Beurteilung von spinalen symmetrischen Verletzungen wie mittelseitiger Kontusion oder Transektionsverletzungen entwickelt, die bilaterale Hinterbeine 14,31betreffen. Bestimmte Parameter der BBB, wie Koordination und Zehenabstand, werden durch die Beobachtung beider Hinterbeine erfasst. Wenn ein Hinterglied intakt ist und der andere Defizite aufweist, wie bei asymmetrischen Verletzungen gesehen, dann wird das intakte Hinterglied die Punktzahl des betroffenen Hinterglieds verwirren. Da die BBB-Wertung nach der einseitigen Verletzung nicht einen Hinterbein-Score vom anderen berücksichtigt, ist sie nicht ideal für die Beurteilung einseitiger Rückenmarksverletzungen. Wenn jedoch gelenke Bewegung und Gewichtsunterstützung auf jeder Seite getrennt bewertet werden und nicht als Teil der BBB berechnet werden, dann wird das intakte Hinterglied (ähnlich einer Scheinkontrolle) die Punktzahl des betroffenen Hinterteils nicht verwirren. Darüber hinaus wird die intakte Seite die Gesamtpunktzahl des Tieres nicht verzerrt, da das intakte Hinterglied keine dramatischen Defizite in der Gelenkbewegung, Gewichtsunterstützung oder Trittweise aufweist.
Die kombinierte Verhaltensbewertung für die Halbsektion ist so konzipiert, dass sie eine sensible und leicht durchgeführte Bewertung der Verhaltenserholung im Rattenmodell der lateralen Halbsektion ist. Es kann verwendet werden, um Verhaltensweisen sowohl der frühen als auch der späten Phase der Wiederherstellung zu bewerten. Die Anfangsphase ist innerhalb von 7-10 Tagen nach der Verletzung. In den ersten 3-5 Tagen nach HX nahm die ipsilaterale Hintergliedaktivität stetig zu und sollte häufiger bewertet werden, um spontane oder behandlungsvermittelte Erholungen der Hinterbeine zu erfassen. Nach 5-7 Tagen nach HX begannen Ratten, schwungvolle Hinterbeine bewegungen ohne Gewichtsunterstützung zu machen. Nach 7-10 Tagen begannen Ratten in der Regel zu stehen und zu treten. In dieser Phase sollte auf das Schrittmuster geachtet werden. In der späten Phase (14-28 Tage) war die ipsilaterale Hinterbleibsaktivität stabil und nahezu normal.
Besondere Aufmerksamkeit sollte auch der Kupplungskapazität (CPL) gewidmet werden. Der CPL-Test (Gangkopplung) kann entweder mit einem Video (z.B. Treadscan/Catwalk) oder einem Filmvideo während eines Open-Field-Tests durchgeführt werden. Die zweite Option bietet Flexibilität, wenn die Forscher keinen Zugang zum Ganganalysesystem haben. Für beide Videoaufnahmesitzungen sind für diesen Test mindestens zwei aufeinander folgende Touchdowns für jeden Fuß erforderlich. Für die Analyse gibt es drei Kopplungsparameter: homologe, homlaterale und diagonale Kopplung (Schritt 6.2). Jede Kupplung beinhaltet einen Referenzfuß und den angegebenen Fuß. Nehmen wir zum Beispiel die homologe Kopplung (vorne links vorne rechts oder nach links hinten rechts), es ist die erste Touchdown-Zeit des gegebenen Fußes geteilt durch eine ganze Schrittzeit des Bezugsfußes. Da der linke und rechte Fuß aus der Phase heraus sein sollte, sollte die perfekte Kupplung 0,5 sein. Dies ist der gleiche Fall bei der homolateralen Kopplung (linke vordere linke Hinterseite oder rechte vordere rechte Hinterseite). Bei der diagonalen Kupplung (linke vordere rechte Hinterseite oder rechte vordere linke Hintern) sollte die perfekte Kupplung jedoch 0 oder 1 sein, da die beiden Füße in der Phase sein sollten. In Schritt 6.4 weisen wir für jede CPL eine Punktzahl von 0 bis 2 zu. Im Detail muss eine Punktzahl 0 den angegebenen Fuß darstellen, der nicht in der Lage ist, einen Touchdown zu beenden, daher keine CPL; eine Punktzahl 1 stellt eine unregelmäßige oder ungeschickte CPL dar, da der angegebene Fuß einen Touchdown beendet, aber nicht in der perfekten Kopplung; eine Punktzahl 2 bedeutet eine perfekte Kopplung von 0,5. Die drei Kopplungsparameterkonzepte sind in den vorherigen Veröffentlichungen32,33gut beschrieben. CPL kann mit den Bewertungen der Kontaktplatzierung und des Gitterlaufens kombiniert werden. Einzelne Komponenten des kombinierten Verhaltensbewertungssystems werden in verschiedenen Rattenmodellen von SCI mehr oder weniger effektiv sein. Für CPL wurden die Defizite offensichtlich in der Wechselrate und der Vollständigkeit der Sequenz sichtbar. Propriozeptive Hinterbeine, die Defizite aufstellen, konnten nach einseitigem HX deutlich aufgedeckt werden. In unserer Studie zeigten alle Ratten ipsilesionale Hinterbeine, die Defizite aufstellten, während die kontralaterale Hinterbeinplatzierung keine Defizite aufwies. Der Raster-Gehtest sollte berücksichtigt werden, wenn die Kontaktplatzierung, die den Kortikospinaltrakt beinhaltet, beginnt sich zu erholen. Um mögliche Ermüdungsprobleme auszuschließen, könnte die Abfolge von Verhaltenstests bei jedem Test randomisiert werden.
Abschließend berichten wir über Schritt-für-Schritt-Verfahren, um ein reproduzierbares In-vivo-Rattenmodell des T9-Spinal-HX zu erstellen, das das Brown-Séquard-Syndrom beim Menschen imitiert. Das kombinierte Verhaltensbewertungssystem für die Hemisektion bietet ein diskriminativeres Maß für individuelle Sbdudenverhaltensergebnisse zur Bewertung von Verletzungsmechanismen und Behandlungen nach einem einseitigen SCI. Obwohl wir nur eine visuelle Beschreibung der chirurgischen Verfahren und Verhaltensbeurteilungen eines thorakalen HX liefern, können die hier beschriebenen Methoden auf andere unvollständige GGIs auf verschiedenen Verletzungsstufen angewendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Herrn Jeffrey Recchia-Rife für seine ausgezeichnete technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von der Stiftung des Direktors des Allgemeinen Krankenhauses der Jinan Military Region von Chines PLA 2016ZD03 und 2014ZX01 (XJL und TBZ) unterstützt. Die Forschung im Xu-Labor wird unterstützt von NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 und Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 vom U.S. Department of Veterans Affairs.
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