Meten van endoreduplicatie door Stroom Cytometry van geïsoleerde Knol protoplasten

Summary

Het protocol hierin beschreven is een methode voor het meten van endoreduplicatie binnen knollen van de aardappel (Solanum tuberosum). Het omvat Plasmolyse en protoplast extractie stappen om te verminderen van het lawaai en puin in downstream flow cytometrische analyse.

Abstract

Endoreduplicatie, de replicatie van de nucleaire genoom van een cel zonder latere cytokinese, cellen met verhoogde DNA-inhoud levert en is gekoppeld aan de specialisatie, ontwikkeling en verhoging van cellulaire grootte. In planten lijkt endoreduplicatie de groei en de uitbreiding van bepaalde weefsels en organen te vergemakkelijken. Onder hen is de knollen van de aardappel (Solanum tuberosum), die aanzienlijke cellulaire uitbreiding bij het vervullen van haar functie van koolhydraten opslag ondergaat. Endoreduplicatie kan dus een belangrijke rol in hoe knollen zijn geschikt voor deze overvloed aan koolstof spelen. Echter, de cellulaire puin als gevolg van ruwe nucleaire isolatie methoden van knollen, methoden die effectief kunnen worden gebruikt met bladeren, verzet zich tegen de schatting van de Knol endoreduplicatie index (EI). Dit artikel presenteert een techniek voor de beoordeling van de Knol endoreduplicatie door de isolatie van protoplasten terwijl demonstreren representatieve resultaten uit verschillende genotypen verkregen en gecompartimenteerd Knol weefsels. De belangrijkste beperkingen van het protocol zijn de kosten van het tijd- en reagens nodig zijn voor de bereiding van de monsters, evenals de relatief korte levensduur van monsters na lysis van protoplasten. Terwijl het protocol gevoelig voor technische variatie is, is het een verbetering ten opzichte traditionele methoden van nucleaire los van deze grote gespecialiseerde cellen. Mogelijkheden voor verbeteringen van het protocol zoals het recyclen van enzym, het gebruik van fixatives en andere wijzigingen zijn voorgesteld.

Introduction

Endoreduplicatie is het proces waarbij een cel afziet van de typische celcyclus en in plaats daarvan een alternatieve cursus van ontwikkeling, bestaande uit herhaalde rondes van DNA-replicatie zonder cellulaire afdeling ondergaat. De resulterende cel zal zijn toegenomen DNA inhoud en nucleaire grootte die wordt beschouwd als een rol spelen in de cellulaire verordening, uitbreiding en specialisatie. In het algemeen, een ronde van endoreduplicatie (genoemd een endocycle) en de overeenkomstige toename van de DNA-inhoud zijn gekoppeld aan grotere cel volume, een waarneming die neergeslagen de ‘karyoplasmic theorie’ dat DNA inhoud toegenomen moet correct het regelen van een grotere, misschien meer complex en cel¹. Dit verschijnsel is gebruikelijk in hogere planten, hebben waargenomen in een aantal weefsels, met inbegrip van die met structurele/defensief (schubben)^2,3, voedend (maïs endosperm)^4,5, en wastafel/opslag ( tomaat zilvervlies; knollen van de aardappel)^6,7,8 functies. In groenten, is er gesuggereerd dat endoreduplicatie speelt een rol bij het vergemakkelijken van de snelle expansie van het zilvervlies worden veroorzaakt, zoals blijkt uit de negatieve relatie tussen endoreduplicatie en fruit developmental periode⁹. Bijvoorbeeld cellen met DNA inhoud tot 512C (512 keer het haploïde genoom) zijn waargenomen in de tomaat zilvervlies⁸. Bovendien Chevalier et al. (2014) aangetoond dat wijzigingen in de expressie van genen van de celcyclus tot toename van endoreduplicatie niveaus binnen het zilvervlies worden veroorzaakt die vervolgens resulteert in grotere vruchten^{10 leiden kunnen}. Wijziging van genen bevordering van endoreduplicatie biedt dus een potentieel doelwit voor verbetering van biomassa of opbrengst door de plantenveredeling of genetische manipulatie. Zo’n verbetering is echter afhankelijk van een beter begrip van de oorzaken en gevolgen van endoreduplicatie.

Endoreduplicatie wordt meestal gemeten via stroom cytometry waarbij kernen, uitgebracht in ruwe weefsel preparaten¹¹, worden geïncubeerd met een DNA-bindende fluorophore, zoals propidium jodide¹² (PI). De gefilterde monsters worden vervolgens doorgegeven door de laser van een stroom cytometer waar emissie golflengten specifiek voor de fluorophore kunnen worden waargenomen. De intensiteit van de fluorescentie in elk geval (dat wil zeggen, nucleus) is direct gecorreleerd met de DNA-inhoud van het deeltje. Dus, door te vergelijken met een bekende norm, de relatieve en absolute DNA inhoud van cellen in een monster kan worden berekend. Endoreduplicatie indexcijfers (EI) worden bepaald door de oprichting van het gemiddeld aantal endocycles per cel binnen een steekproef door het observeren van cellulaire DNA inhoud (C-waarde) waar 1C is de DNA-inhoud van een haploïde cellen (de formule in stap 6.7 van het protocol gepresenteerd). Bijvoorbeeld, in een diploïde organisme is de basisinhoud van DNA van somatische cellen 2C. Als een monster weinig cellen met 4C heeft, een EI in de buurt van 0; zou hebben die overeenkomt met een ronde van endoreduplicatie of groter maar als bijna alle cellen 4C zijn zou het EI ongeveer 1. Zoals meerdere rondes van endoreduplicatie vaak voor bij hogere planten waargenomen EI waarden komen kunnen echter veel groter. Terwijl de berekening van indexcijfers van endoreduplicatie kan worden relatief eenvoudig, dat het vereist dat relatieve abundanties van kernen C-waarden betrouwbaar worden vastgesteld, die in bepaalde soorten en weefsels (inclusief aardappelknollen) is uitgesloten. Het is waarschijnlijk dat verschillen in cellulaire anatomie, chemie of celwand samenstelling¹³ deze monsters veroorzaken worden recalcitrante aan de typische bereidingen met behulp van een scheermesje vrij te geven van de kernen rechtstreeks in passende buffers die vaak worden gebruikt een model voor endoreduplicatie bestudeert met weefsels zoals tomaat zilvervlies,⁸.

In aardappel blijft het onderzoek van endoreduplicatie binnen de Knol beperkt tot slechts een paar studies, misschien gedeeltelijk te danken een gebrek aan een betrouwbaar protocol zoals de bovengenoemde ruwe voorbereidingen inconsistente resultaten opleveren. Terwijl een dergelijke aanpak goed voor bladeren die de Knol monsters ervaring ernstige aantasting en een overvloed aan lawaai in de vorm van puin werkt, differentiatie van pieken bestaat uit de kernen met verschillende C-waarden bijna onmogelijk maken. Dit is misschien te wijten aan verschillen in cellulaire samenstelling en een overvloed van cellulaire puin binnen Knol cellen (bv. amyloplasts zetmeel-slaan). Om te overwinnen deze hindernis, ontwikkelden we onlangs een betrouwbaarder protocol voor de verwerving van onderscheiden pieken in stroom cytometry aardappelknollen. De frequentie van cellen binnen elke piek kan vervolgens worden gebruikt voor de berekening van de nauwkeurige endoreduplicatie niveaus voor verschillende genotypen of verschillende weefsels die deel uitmaken van een Knol. Het protocol, dat maakt gebruik van een gemodificeerde protoplast extractie methode^14,15 antecedent eerder beschreven stroom cytometry¹¹, toonde aanzienlijke variatie binnen de familie van de aardappel, cultivars en weefsels¹⁶ . Hier presenteren we het protocol in detail door te evalueren van EI in de context van ploïdie, weefsel, en de grootte van de knollen.

Protocol

Opmerking: Het is belangrijk op te nemen van de juiste besturingselementen, meestal in de vorm van blad weefsel van de dezelfde ploïdie als experimentele monsters. Dit is omdat de 2C piek van Knol monsters zijn kan klein en moeilijk te identificeren. 1. voorbereiding Opmerking: De oplossingen die hier vermeld kunnen worden bereid tijd vooruit en opgeslagen bij 4 ° C, maar die worden beschreven in de volgende stappen moeten vers worden gemaakt op de dag van gebruik. Make an appropriate volume of Plasmolysis Incubation Solution (PIS) (15 mL/sample): 0.55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris buffer pH 7.5 (adjusted with HCl). Maken van een passende omvang van Plasmolyse Wash oplossing (PWS) (15 mL/monster) die identiek is aan PIS met uitzondering van de toevoeging van 0.71 M mannitol. Breng 250 mL gemodificeerde Galbraith de Stroom Cytometry Buffer11 (FCB): 13.6 mM Natriumcitraat (Trinatriumcitraat), 8 mM MOPS, 18 mM MgCl2, 0,4% v/v Triton X-100. Roer gedurende minstens 30 min voor het distribueren van de Triton X-100. Filter steriliseren PIS en PWS oplossingen met een 0,22 µm asymmetrische polyethersulfon (apen) filter. Vacuüm gedreven filtratie-eenheden gebruiken. Bereiden 106 µm mesh filters voor lysed protoplasten. Bereiden 1,5 mL microcentrifuge buizen die rechtstreeks kunnen worden genest in collectie buizen, maar elke methode van suspensies passeren een 106 µm filter kan worden gebruikt.Opmerking: Deze hoeft niet te worden steriel. Als met behulp van 1,5 mL microcentrifuge buizen, snijd 1 cm van het puntje elke microcentrifuge buis. Met behulp van een warmhoudplaat of andere warmte bron warmte een 1 cm2 stuk 106 µm stalen gaas op een stuk aluminiumfolie. Druk op de gesneden uiteinde van de buis in de Maas totdat zij hebben gesmolten. Wassen aardappelen te bemonsteren, het verwijderen van alle grond en puin.Opmerking: Knol grootte en leeftijd moeten geschikt zijn voor de doelstellingen van het experiment, maar lijken niet te beïnvloeden de kwaliteit van de resultaten. We hebben dit protocol met succes toegepast op knollen die in koude opslag (4 ° C, 95% RH) omhoog tot 8 maanden. Terwijl knollen met defecten (bv Knol einde rot, holle hart, bruin necrotische gebieden) kunnen reageren, moeten ze worden vermeden, indien mogelijk. 2. dag 1: Plasmolyze Knol weefsel Opmerking: Blad controlemonsters kunnen worden opgenomen hier als u wilt produceren protoplasten of op stap 5.2 als ruwe preparaten hebben de voorkeur. Dit moet worden uitgevoerd met steriele instrumenten in een aseptische omgeving zoals een laminaire flow-kap. Oppervlak steriliseren aardappelknollen via onderdompeling in 75% ethanol voor minstens 5 min. Verwijderen van knollen van ethanol en droge lucht. Dit duurt meestal ~ 5 min, langer als de Knol groter dan 100 g is. Bereiden en label steriele 50 mL conische buizen voor elk monster en aliquoot 15 mL van een filter gesteriliseerde PIS in elk. Proeven van ongeveer 1 cm3 van de gewenste weefsel van gesteriliseerde knollen met gesteriliseerde scalpel of kurk borer.Opmerking: Afhankelijk van het weefsel wordt bemonsterd een kunt een gesteriliseerde kurk borer of mes/scalpel. Bijvoorbeeld, het merg is desgewenst de kurk borer mogen worden gebruikt voor het nemen van een kern van de apicale distale daartoe van de knol en het centrale deel van de kern kan worden bemonsterd. Echter, als gevolg van de asymmetrische interne morfologie van aardappelknollen, kan er worden nauwkeuriger te monster parenchym of cortex door halvering van de knol en het gewenste weefsel middendoor. Zie afbeelding 1 voor een afbeelding van interne Knol morfologie. Grof hakken weefsel met behulp van een gesteriliseerde scalpel in ca. 3 mm3 stuks en overdracht weefsel aan conische buis met PIS. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C.Nota: Dit is naar het maximaliseren van de oppervlakte zodat ««««de PIS, en later de enzym-oplossing, volledig het weefsel wat resulteert in meer volledige spijsvertering kan doordringen. Figuur 1: interne morfologie van een aardappel Knol. De scheiding tussen merg (P) en perimedullary parenchym (PM) is geïllustreerd met zwarte lijnen. De vaatring, die parenchym van de cortex (C scheidt) wordt aangeduid met een zwarte pijl. De stolonen einde (S) en de Knol ogen (E) worden eveneens aangeduid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 3. dag 2: Genereren aardappel protoplasten Opmerking: Dit moet worden uitgevoerd met steriele instrumenten in een aseptische omgeving zoals een laminaire flow-kap. Bereiden en te filteren (0,45 µm apen filter) een geschikte hoeveelheid van de oplossing van de enzym (ES) (10 mL/monster): 0.71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0.8% macerozyme R-10, 1% hemicululase, 10 mM MES buffer, pH 5,8. Zorgen dat de juiste filters worden gebruikt in deze stap; filters met porie grootte kleiner dan 0,45 µm zijn gevoelig voor verstopping overwegende dat een laag eiwitgehalte bindende membraan, zoals apen, verlies van enzym gedurende filtratie minimaliseert. Gecombineerd uit PIS van monsters in conische buisjes met behulp van een steriele serologische pipet. Voeg 10 mL van ES aan elk monster en omkeren 2 tot 3 keer. Incubeer monsters ‘s nachts bij 29 ° C met 180 rpm horizontale schudden. Incubeer monsters gedurende ten minste 16 uur. 4. dag 3: Oogst protoplasten en Wash protoplasten Opmerking: Aseptische condities zijn op dit punt niet lang nodig. Monsters uit shaker verwijderen en laten regelen voor ~ 10 min. Gecombineerd uit zo veel van de ES-oplossing mogelijk. Verwijder zo veel van de ES-oplossing als haalbaar met een serologische Pipet, verzorgen om te voorkomen dat het verteerd weefsel te verwijderen. Met behulp van een micropipet verwijderen elke resterende ES oplossing, opnieuw te vermijden het verteerd weefsel. Dit gebeurt meest gemakkelijk door te houden van de buis onder een hoek, zodat de oplossing ES richting het deksel stroomt terwijl het verteerd weefsel aan de onderkant blijft. Voeg toe 15 mL PWS aan elk monster en voorzichtig omkeren 2 tot 3 keer. Het toestaan van protoplasten gedurende 10 minuten bezinken. Verwijder PWS met een serologische pipet. Gebruik een micropipet om te verwijderen van alle resterende vloeistof.Opmerking: Deze stap is cruciaal om de integriteit van de kernen monster tijdens stroom cytometry. In het oplossen van problemen, is deze stap bleek te zijn de meest waarschijnlijke bron van storing in een steekproef. 5. dag 3: Monsters voorbereiden op Stroom Cytometry Opmerking: De monsters moeten worden bewaard op ijs vanaf hier op tenzij anders vermeld. Voorbereiden propidium jodide (0.4 mg propidium jodide/mL FCB) en RNase oplossingen (0,8 mg RNase A / mL FCB) door het oplossen van elk in FCB.Let op: Propidium jodide is zeer giftig. Vermijd contact met de huid of ogen. Draag passende PPE. Voeg 1,5 mL ijs koud FCB aan elk monster. Even schudden of vortex elk monster te breken geaggregeerde weefsel. Het is belangrijk te breken van de bosjes van Knol weefsel zodat de FCB kan volledig doordringen van de cellen en het vrijgeven van de kernen. Verschillende monsters kunnen meer of minder agitatie afhankelijk van weefsel en genotype vereisen.Opmerking: De FCB lyses de protoplasten, het vrijgeven van de kernen. Vandaar monsters de noodzaak om op ijs om degradatie te voorkomen. Als stroom cytometry controlemonsters niet in de protoplast generatie stap opgenomen werden mogen ze hier worden opgenomen. Als een besturingselement toegevoegd wordt, fijn hakken een klein blad (~ 3 cm2) in 1,5 mL ijs koud FCB met behulp van een scheermesje. Controlemonsters moet de dezelfde ploïdie als de experimentele monsters, bij voorkeur dezelfde genotype. In vitro plantjes neiging om schonere pieken dan kas of veld gekweekte planten. 1 mL van de FCB/weefsel schorsing passeren een 106 µm mesh filter. Gebruik van een 1,5 mL microcentrifuge tube met de tip afgesneden en metalen gaas gesmolten naar de bodem, zoals beschreven in stap 1.5.1. Deze microcentrifuge-buis kan worden genest rechtstreeks in een tube van 2 mL microcentrifuge en het monster percoleren direct. Als met een andere methode van filtratie, kan het filtraat worden verzameld in een ijskoude Petri-plaat en vervolgens overgedragen aan een 2 mL-buis.Opmerking: soms de resterende aggregaten en cellulaire puin kunnen verstoppen de mesh filter. In dit geval gewoon tik op de twee buizen van de geneste microcentrifuge een paar keer te verjagen van het puin. Voeg toe 250 µL van de RNase oplossing aan elk monster. Omkeren en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).Opmerking: Deze stap is bedoeld om RNA van de monsters, wat leidt tot minder lawaai tijdens stroom cytometry. Echter, zoals de kernen zijn van korte duur, onderzoekers kunnen besluiten te verlagen de incubatietijd of het uit te voeren op ijs als zij ernstige aantasting van hun monsters ondervindt. 125 µL van de propidium jodide oplossing aan elk monster toevoegen. Omkeren en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.Opmerking: Monsters moeten worden gebruikt voor stroom cytometry zo spoedig mogelijk als aantasting is herkenbaar binnen 2 uur, zelfs op het ijs. 6. dag 3: Stroom Cytometry van aardappel Knol kernen Opmerking: Flow cytometer werking en software hangt af van het instrument en de fabrikant. Gedetailleerde instructies over de specifieke werking van de cytometer van de stroom zal worden verstrekt in de gebruikershandleiding van het instrument. Maak twee dot plots met behulp van logaritmische schaal van voorwaartse spreiding vs. kant spreidings- en propidium jodide (PI) vs kant scatter. Ook maken een histogram met PI op de x-as. Logaritmische schaal nodig is om dat alle gebeurtenissen liggen op schaal net als kernen in fluorescentie sterk afwijken. Een bekende controle monsterbuisje laden en aanpassen van de spanning zodat alle evenementen op schaal zijn. We gebruiken in vitro blad weefsel van een monster genotype. Als voorbeelden van verschillende ploidies worden uitgevoerd moeten, moet een controlemonster voor elk worden opgenomen. Let op het kanaal van de 2C-piek in de controlemonster. De 2C-pieken van de experimentele monsters moeten vallen op dezelfde locatie. Laden van een experimentele (Knol) monster en weer ervoor zorgen dat alle gebeurtenissen op schaal. Als aanpassingen nodig, herhaal zijn stap 6.2 te identificeren van het kanaal van 2C pieken. Poort handmatig de protoplast-kernen met behulp van de kant scatterplot vs PI. Het histogram van de PI te tonen alleen de gated protoplast kernen regio instellen Het gewenste aantal gebeurtenissen verzamelen van elk monster. Onderzoekers gebruiken vaak 10.000 gated gebeurtenissen voor stroom cytometry; we gebruiken echter 2.000 gebeurtenissen voor Knol protoplast monsters meer monsters en monsters met een lage concentraties te vangen. Berekenen van elk monster EI van de PI histogrammen met de volgende formule:EI =waar 4C is het percentage van de kernen die 4C (namens een ronde van endoreduplicatie), is 8C het percentage waarmee de 8C, enzovoort. Zie Figuur 4 voor voorbeelden van histogrammen en C-waarden van pieken.

Representative Results

Productie van protoplasten De generatie van protoplasten is nodig om herhaalbare stroom cytometry resultaten uit aardappelknollen, de algemene morfologie van die is weergegeven in Figuur 1. Onderzoekers kunnen willen zorgen hoogwaardige protoplasten zijn geproduceerd voordat het prestatiemeteritembestand van de FCP, met name in het geval dat probleemoplossing vereist is. De meerderheid van de protoplasten moet bolvormig met minimale uitsteeksels (Figuur 2) en kan verschillen sterk in grootte, die is misschien een afspiegeling van verschillen in EI. Figuur 2: vertegenwoordiger blad- en knolgewassen protoplasten verworven op stap 4.4 van het protocol. Geïsoleerde protoplasten moet bolvormig en symmetrisch met plasmamembraan intact. Opmerking de grootte verschil tussen blad (A-C), evenals Knol (D, E) protoplasten en de verschillen in grootte binnen een weefsel die op verschillende niveaus van endoreduplicatie wijzen kan. Blad protoplasten bevatten chloroplasten, terwijl amyloplasts zichtbaar in de Knol protoplasten zijn. Schaal bars = 1.000 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Evaluatie van stroom cytometry resultaten Het slagen of mislukken van een experiment kan worden afgemeten aan de breedte van pieken en hun scheiding in de stroom cytometry histogrammen. Zoals meten endoreduplicatie berekening van de relatieve abundantie van de kernen in elke piek vereist, is loutere aanwezigheid of afwezigheid van pieken onvoldoende als er teveel ruis grenzen moeten worden getrokken zinvolle ertussen. Figuur 3 toont de variatie in resultaten onderzoekers in zowel de stroom cytometry scatter Staanplaatsen en histogrammen tegenkomen. Mogelijke oorzaken voor mislukte monsters worden gepresenteerd in de discussie. Figuur 3: representatieve resultaten verkregen stroom cytometry van de protoplast kernen van intact en merg monsters gedegradeerd. Intact kernen (A) tonen schone scheiding tussen pieken te kwantificeren van relatieve abundantie van de cellen in elk gebruik van de juiste software, overwegende dat pieken in de aangetaste monsters (B) Toon verschoven, breed en overlappende grondslagen. In de scatterplots van intact (C) en aangetaste (D) monsters, zwarte vakken geven aan nucleaire gebeurtenis gating voor histogrammen en clustering van gebeurtenissen wordt weerspiegeld in de breedte van de pieken van het histogram. Gebeurtenissen buiten de poorten duiden puin, zwaar aangetaste kernen of andere aggregaten. PI-H komt overeen met de intensiteit van de fluorescentie die wordt gemeten in willekeurige eenheden. Methoden voor probleemoplossing om te voorkomen dat de aantasting van het monster worden besproken binnen de tekst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Endoreduplicatie verschillen tussen weefsels Eerder meldden wij dat Knol merg weefsel aanzienlijk grotere niveaus van endoreduplicatie dan cortex weefsel16 heeft. Om te bevestigen en uit te breiden op dit hebben we gekeken naar endoreduplicatie niveaus van drie verschillende weefsels in cv. Superior: merg, perimedullary parenchym en cortex, gerepliceerd in drievoud met 2.000 gated gebeurtenissen per monster. Onze resultaten bevestigd onze eerdere waarnemingen dat merg weefsel aanzienlijk meer EI dan corticale weefsel met middelen van 1.79 en 1.12 endocycles per cel, respectievelijk heeft (p = 0.018; Van de student t-test). Enigszins verrassend, het parenchym weefsel aangetoond een profiel vergelijkbaar met cortex en was ook sterk afwijkt van merg weefsel (betekenen = 1.14; p = 0,013; Van de student t-test). Deze resultaten worden samengevat in Figuur 4. Figuur 4: endoreduplicatie in drie weefsels van cv. Superior. Histogrammen van blad (A), Knol cortex (B), (C) parenchym en merg (D) weefsels worden getoond samen met het EI-waarde berekend op basis van deze histogrammen. Verschillen in relatieve abundantie van de kernen bestaande uit elke piek zijn overduidelijk, met name tussen blad- en knolgewassen weefsels. C-waarden voor elke piek worden ook weergegeven. PI-H komt overeen met de intensiteit van de fluorescentie die wordt gemeten in willekeurige eenheden. Bedoel vergelijkingen voor EI van Knol weefsels worden weergegeven in E waar asterisk significant verschil geeft (p < 0,05) en foutbalken Toon standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Invloed van de grootte van de knollen en ploïdie Eerder meldden wij dat knollen van verschillende grootte maar vergelijkbare looptijd voor een bepaald genotype, een overeenkomstige verschil in EI16niet heeft weergegeven. We wilde bevestigen dit resultaat, evenals de relatie tussen ploïdie en endoreduplicatie evalueren. Voor dit experiment, gebruikten we drie replicaat-organismen van parenchym weefsel van drie verschillende genotypen: cv. Superior (4 x), VT_SUP_19 (2 x) die een dihaploid wordt gewonnen uit cv. Superior door prickle bestuiving17en VT_SUP_19 4 x die een verdubbelde dihaploid 18 isogene aan VT_SUP_19. We omvatte een reeks van replicatieonderzoeken voor grote (90-130 g) en kleine (< 35 g) knollen voor cv. Superior terwijl de knollen voor de andere twee genotypen werden 90-130 g. De knollen waren allemaal geoogst uit de kas planten geteeld op volledige looptijd, dat wil zeggen de toppen van de planten had senesced. We hebben vastgesteld dat een significant verschil tussen VT_SUP_19 en zijn voorvader Superior (p = 0,04); echter was er geen significant verschil tussen VT_SUP_19 en VT_SUP_19 4 x (p = 0,69). Dit geeft aan dat er weliswaar een waarschijnlijk genetische component aan endoreduplicatie, als ontmaskerd door de genomic reductie, het niet door ploïdie, ten minste in deze achtergrond ingegeven is. Tot slot, nogmaals zien we geen significante verschillen tussen grote en kleine cv. superieure knollen zoals aangetoond in Figuur 5. Figuur 5: endoreduplicatie in twee maten knollen van cv. Superior en zijn diploïde (VT_Sup_19) en tetraploïde (VT_Sup_19 4 x) derivaten. Het staafdiagram toont het gemiddelde voor kleine (< 35 g) en grote (90-130 g) cv. superieure knollen, alsmede grote (90-130 g) knollen van de dihaploid VT_SUP_19 en de isogene verdubbelde dihaploid VT_SUP_19 4 x. Significante verschillen (p < 0.05) worden aangeduid met de aansluitende verslag van de brief. Foutbalken verbeelden standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het protocol gepresenteerd hierin biedt onderzoekers met een middelen ter beoordeling van endoreduplicatie binnen aardappelknollen, waarvan gemodificeerde mobiele inhoud en grotere cel grootte schijnbaar beletsel voor andere stroom cytometry preparaten. Het protocol is gebaseerd op protoplast generatie als een middel ter vermindering van lawaai en puin met behoud van de nucleaire integriteit. Eerder, onderzoekers hebben dergelijke preparaten voor met name recalcitrante stroom cytometry monsters beschreven evenals gebruikt Knol protoplasten om te bestuderen van een verscheidenheid van onderwerpen zoals pathogenese^19,20. Om onze kennis, hebben geen echter het gebruik van dergelijke Knol protoplasten gecombineerd met stroom cytometry met het oog op het bestuderen van endoreduplicatie. Bovendien vonden we het gebruik van protoplasten meer betrouwbaar dan typische ruwe preparaten alsmede de techniek gebruikt in de twee alleen andere studies om te beoordelen van de Knol endoreduplicatie^6,7. Hier bespreken we de tekortkomingen van het protocol, de potentiële valkuilen in uitvoering en sample voorbereiding, en resultaten van een typisch experiment waarin het werkzaam.

Ondanks het nut en de herhaalbaarheid van de Knol stroom cytometry protocol, beschikt het over een paar zwakke punten die moeten worden besproken. Om te beginnen, is het protocol tijd intensief, waarbij twee nachtelijke incubations. Voorts vereist het protocol dat sommige dure reagentia, met name de cellulase en macerozyme. De voorbereidingen zijn bovendien zeer tijd-gevoelige, vernederende binnen een paar uur, die doorvoer binnen een enkele dag, beperken kunnen vooral als zijn vele evenementen gewenst. Tot slot, het protocol, terwijl betrouwbaar, is gevoelig voor fouten in de bereiding van de monsters die alle lijken te resulteren in schade aan de nuclei en lagere kwaliteitsresultaten. Microbiële besmetting kan zich bijvoorbeeld voordoen tijdens de Plasmolyse en protoplast generatie stappen (1-3.4) als gevolg van onjuiste aseptische techniek. Verontreiniging van de steekproef, terwijl niet altijd de uitschakeling van het succes van een steekproef, lijkt drastisch verminderen kwaliteit van verkregen histogrammen, opnieuw kunnen wegens schade aan de kernen.

Zoals eerder vermeld zijn de grote nadelen van het protocol kosten, tijd en gevoeligheid voor fouten. Onderzoekers desgewenst stappen te nemen om elk van deze verzachten. Wat betreft kosten, onderzoekers die voornemens is toe te passen van het protocol op vele monsters kunnen beschouwen de concentraties van het enzym en/of de duur van de spijsvertering stap wijzigen als verschillende weefsels en genotypen variëren in responsiviteit. Dit omvat de mogelijkheid van filtering en recycling van de ES die is eerder aangetoond maar niet werkzaam hier²¹. Wat betreft tijd, in onze waarneming, kan men afzien van de eerste incubatie (de Plasmolyse stap) en nog steeds pak protoplasten; echter, hun integriteit en overvloed zullen lijden, die een negatieve invloed resultaten. Ter vermindering van de achteruitgang van de monsters overwegen onderzoekers dat sommige benaderingen van stroom cytometry gekenmerkt door het gebruik van fixatives (bijvoorbeeld formaldehyde) voor het behoud van monster integriteit²². Dit kan zijn een nuttig middel om zowel achteruitgang en toestaan voor monster opslag in plaats van protoplast productiegoederen en stroom cytometry die plaatsvinden op dezelfde dag gepresenteerd. Een ander middel om te voorkomen dat het verloop van de kernen kunnen worden opgenomen van een inhibitor van de nuclease de ES en/of FBC; terwijl 2-mercaptoethanol geen merkbare veranderingen tijdens de ontwikkeling verricht, zijn andere remmers niet getest hierin.

In onze waarneming is de meest kritische stap stap 4.4, de verwijdering van alle Plasmolyse wassen oplossing vóór de toevoeging van de stroom cytometry buffer (FCB). Als zelfs een klein volume (< 10 µL) blijft, de monsters zijn veel meer kans te worden gedegradeerd die kunnen leiden tot een slecht of zelfs falend monster. Dit is waarschijnlijk te wijten aan onzuiverheden in de oplossing van het enzym (b.v. nucleasen, proteasen)^23,24 , die snel verslechteren de kernen tijdens de incubatie perioden en de tijd tussen monster runs, zelfs bij lage concentraties. Een andere belangrijke overweging is de duur van de PI en RNase incubatie stappen. Zoals opgemerkt in het protocol, blijven de monsters niet stabiel voor meer dan een paar uur na toevoeging van de FCB zodat onderzoekers beslissen kunnen om de duur van deze stappen om meer monsters of lange stroom cytometry loopt als gevolg van lage kernen concentraties. Dit vereist ook de onderzoeker te overwegen de afweging tussen het aantal gebeurtenissen per monster en het totale aantal monsters worden uitgevoerd of overwegen het gebruik van fixatives zoals eerder genoemd.

Verschillen tussen weefsels en genotypen

Om de vertegenwoordiger van de resultaten van het protocol ontworpen we twee eenvoudige experimenten bevestigen eerder gemelde variatie door weefsel te onderzoeken van de invloed van ploïdie en genotype. De resultaten van het weefsel experiment tonen aan dat het protocol reproduceerbare resultaten levert, zoals merg weefsel bleek eens te meer dat de hoogste EI. Enigszins verrassend parenchym weefsel, dat had niet eerder geëvalueerd, had een waarde van het EI vergelijkbaar met corticale weefsel en aanzienlijk lager is dan het merg. Dit was een onverwachte zoals parenchym cellen meestal groter dan merg of corticale cellen, ten minste op de vervaldag zijn. Een mogelijke verklaring is dat de knollen (90-130 g) ook onrijpe voor de parenchym-cellen, die de meerderheid van de Knol volume op de vervaldag waren, volledig uitgebreid en bereiken hun maximale C-waarden²⁵omvatten. Dit kan ook verklaren waarom de dihaploid (VT_SUP_19) en de verdubbelde dihaploid (VT_SUP_19 4 x) blijkt significant groter EI dan cv. superieure knollen; terwijl de knollen van ongeveer gelijke grootte werden bemonsterd van elk genotype, is de maximale grootte van de knollen uit VT_SUP_19 of de isogene tetraploïde veel kleiner dan die van de voorvader. Dus het kan zijn dat ze meer EI gewoon weergegeven omdat ze groter ten opzichte van hun maximumgrootte haalbaar waren. Anderzijds mag het verschil, een gevolg van de genetische aanvulling die vt_sup_19 haar tetraploïde voorlopercellen ontvangen. Een andere mogelijkheid is dat de genomic vermindering die plaatsvond op de winning van de dihaploid van de tetraploïde schadelijke allelen resulterend in plant-wide stress, dat is ook aangetoond bij te dragen tot verhoogde EI²⁶ontmaskerd kan hebben. Niettemin, hieruit blijkt dat de onderzoekers zorgvuldige afweging moeten aanwenden bij het selecteren van de knollen en weefsels moet worden gebruikt voor de vergelijking van de EI-waarden, met name tussen genotypen.

Toekomstige toepassingen

Voorziet het protocol in dit artikel beschreven onderzoekers met een belangrijk begrip endoreduplicatie in aardappel. Het kan toestaan voor studies naar de genetische en omgevingsfactoren componenten van endoreduplicatie, het tijdsverloop van de ontwikkelingsniveaus van de Knol weefsels, en beoordeling van natuurlijke variatie. Endoreduplicatie kan uiteindelijk een veelbelovende doelwit voor aardappel verbetering, een onderneming waarvoor een betrouwbare middelen van beoordeling zal maken.

Materials

Serological pipette	Fisher	13-676-10k	(sterile)
Pipet Aid XP (autopipettor)	Drummond Scientific	4-000-101
Conical tubes (50 ml)	Thermo Fisher Scientific	339652	(sterile)
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Globe Scientific	111558
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Globe Scientific	111552
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES)	Thermo Fisher Scientific	564-0020	(sterile)
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES)	Thermo Fisher Scientific	168-0045	(sterile)
Cellulase "Onozuka R-10"	Yakult		contact company
Macerozyme "Onozuka R-10"	Yakult		contact company
Hemicellulase	Sigma	H2125
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
MES buffer	Acros Organics	172590250
Triton X-100	MP Biochemicals	194854
Magnesium Chloride (hexahydrate)	Fisher Scientific	M35-500
Calcium Chloride (dihydrate)	Fisher Scientific	C79-500
D-Mannitol	Acros Organics	423922500
MOPS	Acros Organics	17263-0250
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)	Sigma-Aldrich	P-5379
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4170	For flow cytometry preparations
Ribonuclease A	Sigma-Aldrich	R5000	For flow cytometry preparations
Cork borers with punch	American Scientific	2093-02	For smapling desired tissue
Forceps	Thermo Fisher Scientific	16-31	For smapling desired tissue
Scalpel	Thermo Fisher Scientific	08-920B	For smapling desired tissue
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size	New Jersey Wire Mesh Co.		contact company