Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen
Summary
Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.
Abstract
De vangst van de kruising van de chromatine-geassocieerde eiwitten voor proteomics (HyCCAPP) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld om nieuwe DNA-eiwit interactie in gist bloot te leggen. Het staat de analyse van een regio van doelstelling van belang zonder de noodzaak van voorafgaande kennis over waarschijnlijk eiwitten gebonden aan de target-regio. Hierdoor, in theorie, kan HyCCAPP worden gebruikt om te analyseren welke genomic regio van belang, en het biedt voldoende flexibiliteit om te werken in verschillende cel systemen. Deze methode is niet bedoeld om te studeren bandplaatsen van bekende transcriptiefactoren, een taak die beter geschikt voor Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine en ChIP-achtige methoden. De sterkte van HyCCAPP ligt in haar vermogen om te verkennen DNA regio’s waarvoor er beperkte is of geen kennis over de eiwitten gebonden. Ook kan het een handige methode om te voorkomen dat vooroordelen (aanwezig in ChIP-achtige methoden) geïntroduceerd door op basis van eiwitten chromatine verrijking met antilichamen. HyCCAPP kunnen potentieel, een krachtig hulpmiddel om te ontdekken de echt nieuwe DNA-eiwit interactie. Tot op heden, is de technologie overwegend vereffend gistcellen of hoge kopie herhalen sequenties in zoogdiercellen. Om de krachtige tool die we voor ogen, moeten HyCCAPP benaderingen worden geoptimaliseerd voor het efficiënt vastleggen single-kopie loci in zoogdiercellen. Hier presenteren wij onze aanpassing van de initiële gist HyCCAPP vangen protocol bij menselijke cellijnen, en tonen dat single-kopie chromatine regio’s kunnen worden efficiënt geïsoleerd met dit gewijzigde protocol.
Introduction
Tijdens het afgelopen decennium heeft gezien een dramatische verbetering in sequencing technologieën, de studie van een breed scala van genomen in grote aantallen monsters, en met verbazingwekkende resolutie toe te staan. De encyclopedie van DNA elementen (CODEER) Consortium, een grootschalige multi institutionele inspanning onder leiding van de National Human Genome Research Institute van de National Institutes of Health, heeft verstrekt inzicht in hoe individuele transcriptiefactoren en andere regelgevende eiwitten binden aan en interactie met het genoom. De eerste poging gekenmerkt specifieke DNA-eiwit interacties, zoals beoordeeld door chromatine immunoprecipitation (ChIP) voor meer dan 100 bekende DNA-bindende eiwitten1. Alternatieve methoden zoals DNase footprinting2 en formaldehyde geassisteerde isolatie van regelgevende elementen (FAIRE)3 zijn ook gebruikt om te zoeken op specifieke regio’s van het genoom interactie met eiwitten, maar met de duidelijke beperking die deze experimentele benaderingen identificeren de interacterende eiwitten niet. Ondanks de omvangrijke inspanningen het afgelopen jaar, is geen enkele technologie gebleken waarmee efficiënt de uitgebreide karakterisering van eiwit-DNA interacties in de chromatine, en de identificatie en kwantificering van chromatine-geassocieerde eiwitten.
Om aan deze behoefte, ontwikkelden we een nieuwe benadering die wij als Hybridization Capture of Chromatin-Associated eiwitten voor Proteomics (HyCCAPP) genoemd. In eerste instantie ontwikkeld in gist4,isoleert5,6, de aanpak kruisverwijzende chromatine regio’s van belang (met afhankelijke eiwitten) met behulp van sequentie-specifieke hybridisatie vastleggen. Na isolatie van de eiwit-DNA complexen, kunnen benaderingen zoals massaspectrometrie worden gebruikt voor het karakteriseren van de set van eiwitten gebonden aan de opeenvolging van belang. HyCCAPP kan dus worden beschouwd als een niet-vooringenomen aanpak te ontdekken van nieuwe DNA-eiwit interactie, in de zin dat het niet afhankelijk is van antistoffen en het is volledig neutraal over de eiwitten dat zou kunnen worden gevonden. Er zijn andere benaderingen kan ontdekken roman DNA-interactie eiwitten7, maar meest vertrouwen op ChIP-achtige methoden8,9,10, plasmide invoegingen11,12, 13,14, of regio’s met hoge kopie nummers15. In tegenstelling, HyCCAPP kan worden toegepast op multi – en single-copy regio’s, en het vereist geen voorafgaande informatie over de eiwitten in de regio. Bovendien, terwijl sommige van de methoden vermeld hierboven hebben waardevolle functies, met name het vermijden van de noodzaak voor DNA-proteïne crosslinking reacties, het unieke kenmerk van HyCCAPP is dat het kan worden toegepast op één-kopie provincies in ongewijzigde cellen, en zonder enige voorkennis over vermeende bindende proteïnen of antilichamen beschikbaar.
Op dit punt, HyCCAPP is voornamelijk toegepast op de analyse van verschillende genomic regio’s in gist4,5,6, en onlangs werd gebruikt voor het analyseren van eiwit-DNA interacties in alpha-satelliet DNA, een herhalingsgebied in het menselijk genoom16. Als onderdeel van onze lopende werkzaamheden, hebben we de kruising vangen aanpak in eerste instantie ontwikkeld voor gist chromatine te gelden voor de analyse van menselijke cellen, die hier aanwezig zijn een gewijzigde protocol waarmee het selectieve vangen van single-kopie doel aangepast regio’s in het menselijk genoom met efficiëntie vergelijkbaar met onze aanvankelijke studies in gist. Dit nieuwe geoptimaliseerde protocol staat nu de aanpassing en het gebruik van de technologie te ondervragen van eiwit-DNA interacties over het menselijk genoom, met behulp van massaspectrometrie of andere analytische benaderingen.
Het is belangrijk om te benadrukken dat de HyCCAPP-methode is bedoeld voor de analyse van specifieke doelregio’s en nog niet geschikt voor genoom-brede analyse is. De technologie is vooral nuttig bij de behandeling van de regio’s waarvoor bestaat de schaarse informatie over interacterende eiwitten, of wanneer een uitgebreidere analyse van interacterende eiwitten op een specifieke genoom locus is gewenst. HyCCAPP is bedoeld om te ontdekken van DNA-bindende proteïnen maar niet karakteriseren nauwkeurig de specifieke proteïne bandplaatsen in genomic DNA. In de huidige uitvoering ervan biedt de methodologie geen informatie over de binding van de DNA sequenties of motieven voor individuele eiwitten. Dus het mooi is een aanvulling op de bestaande technologieën zoals FAIRE en kan toestaan dat de identificatie van nieuwe bindende proteïnen in genomic gebieden geïdentificeerd door een eerste analyse van de FAIRE.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode van HyCCAPP heeft vele unieke functies waarmee u gemakkelijker een krachtige aanpak van DNA-interacties die anders elusive blijven zou ontdekken. De aard van het proces geeft HyCCAPP de flexibiliteit om te werken in verschillende organismen en regio’s van het genoom. Het is een methode, die heeft echter verschillende beperkingen te worden beschouwd.
HyCCAPP is een methode die voorkomt van wijzigingen van de cel zodat het potentieel kan worden toegepast in elektrische…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH Grants P50HG004952 en R01GM109099 naar MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
