Anpassning av hybridisering fånga av kromatin-associerade proteiner för proteomik för att däggdjursceller
Summary
Detta är en metod för att identifiera nya DNA-interagera proteiner vid specifika loci, förlitar sig på sekvens-specifika tillfångatagandet av tvärbunden kromatin för efterföljande proteomiska analyser. Det krävs inga förkunskaper om potentiella bindande proteiner eller cell ändringar. Ursprungligen utvecklades för jäst, har tekniken nu anpassats för däggdjursceller.
Abstract
Hybridisering tillfångatagandet av kromatin-associerade proteiner för proteomik (HyCCAPP) teknik utvecklades ursprungligen för att avslöja nya DNA-protein interaktioner i jäst. Det tillåter analys av en målregionen sevärdheter utan behov av förkunskaper om sannolikt proteiner bunden till målregionen. Detta, i teorin, tillåter HyCCAPP att användas för att analysera någon genomisk region av intresse, och det ger tillräcklig flexibilitet för att arbeta i olika cellsystem. Denna metod är inte tänkt att studera bindningsställen av kända transkriptionsfaktorer, en uppgift som bättre lämpade för kromatin Immunoprecipitation (ChIP) och ChIP-liknande metoder. HyCCAPP styrka ligger i dess förmåga att utforska DNA-regioner för vilka det finns begränsad eller ingen kunskap om proteinerna bunden till den. Det kan också vara en bekväm metod för att undvika fördomar (närvarande i ChIP-liknande metoder) infördes genom protein-baserade kromatin berikning med hjälp av antikroppar. Potentiellt, kan HyCCAPP vara ett kraftfullt verktyg för att avslöja verkligen roman DNA-protein interaktioner. Hittills har tekniken använts huvudsakligen jästceller eller hög kopia upprepa sekvenser i däggdjursceller. För att bli den kraftfulla verktyg som vi föreställer oss, måste HyCCAPP strategier optimeras för att effektivt fånga singel-kopia loci i däggdjursceller. Här presenterar vi vår anpassning av inledande jäst HyCCAPP capture protokoll till mänskliga cellinjer och visa att singel-kopia kromatin regioner kan isoleras effektivt med detta modifierade protokoll.
Introduction
Under det senaste decenniet har det sett en dramatisk förbättring i sekvensering teknik, möjliggör studiet av ett brett utbud av arvsmassan i stort antal prover, och med häpnadsväckande upplösning. Encyklopedi av DNA element (koda) konsortiet, en storskalig flera institutionella insats i spetsen av den nationella Human Genome Research Institute av National Institutes of Health, har gett insikter i hur enskilda transkriptionsfaktorer och andra reglerande proteiner binder till och interagera med genomet. Den inledande insatsen kännetecknas specifika DNA-protein interaktioner, enligt bedömning av kromatin immunoprecipitation (ChIP) för över 100 kända DNA-bindande proteiner1. Alternativa metoder såsom DNAS Footprints2 och formaldehyd assisterad isolering av reglerande element (FAIRE)3 har också använts för att hitta specifika regioner i genomet interagerar med proteiner, men med den uppenbara begränsningen som dessa experimentella metoder identifierar inte de samverkande proteinerna. Trots de omfattande ansträngningarna de senaste åren, har ingen teknik framkommit att effektivt tillåter omfattande karakterisering av protein-DNA interaktioner i kromatin, och identifiering och kvantifiering av kromatin-associerade proteiner.
För att bemöta detta behov, har vi utvecklat en ny metod som vi kallas som Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteiner för proteomik (HyCCAPP). 5,6, strategin från början utvecklades i jäst4,och isolerar tvärbundna kromatin regioner av intresse (med bundna proteiner) med sekvens-specifika hybridisering capture. Efter isolering av de protein-DNA-komplex, kan metoder såsom masspektrometri användas att karakterisera uppsättningen proteiner bunden till sekvensen av intresse. HyCCAPP kan således betraktas som en icke-partisk inställning till avslöja nya DNA-protein interaktioner, i den meningen att det inte bygger på antikroppar och det är helt agnostiker om de proteiner som kan hittas. Det finns andra metoder som kan avslöja roman DNA-interagera proteiner7, men mest beroende av ChIP-liknande metoder8,9,10, plasmid infogningar11,12, 13,14, eller regioner med hög kopia nummer15. Däremot HyCCAPP kan tillämpas på multi – och single-kopia regioner, och det kräver inte någon förhandsinformation om proteinerna i regionen. Dessutom, medan några av metoderna som nämns ovan har värdefulla funktioner, särskilt undvika behovet för DNA-protein crosslinking reaktioner, det unika med HyCCAPP är att det kan tillämpas på singel-kopia regioner i omodifierade celler, och utan någon förkunskaper om förmodad bindande proteiner eller tillgängliga antikroppar.
Vid denna punkt, HyCCAPP har huvudsakligen använts för analysen av olika genomisk regioner i jäst4,5,6, och användes nyligen till att analysera protein-DNA interaktioner i alpha-satellit DNA, en upprepad region i den mänskliga arvsmassa16. Som en del av vårt pågående arbete, har vi anpassat metoden hybridisering fånga ursprungligen utvecklades för jäst kromatin tillämpas på analysen av mänskliga celler och presenterar här ett modifierat protokoll som tillåter selektiv fångst av singel-kopieringsmål regioner i det mänskliga genomet med effektivitetsvinster liknar våra inledande studier i jäst. Detta nya optimerade protokoll tillåter nu anpassning och utnyttjande av teknik för att förhöra protein-DNA-interaktion över det mänskliga genomet, med hjälp av masspektrometri eller andra analytiska metoder.
Det är viktigt att understryka att metoden HyCCAPP är avsedd för analys av specifika målregionerna och ännu inte är lämplig för genome-wide analyser. Tekniken är särskilt användbart när det gäller regioner där det finns knappa information om samverkande proteiner, eller när en mer omfattande fördjupad analys av samverkande proteiner på en specifik genomet locus önskas. HyCCAPP är tänkt att avslöja DNA-bindande proteiner men inte kännetecknar exakt de specifika protein bindningsställen i genomisk DNA. I det nuvarande genomförandet ger metoden inte information om DNA-bindning sekvenser eller motiv för enskilda proteiner. Därför det fint kompletterar befintlig teknik såsom FAIRE, och tillåta identifiering av romanen bindande proteiner i genomisk regioner identifieras genom en inledande FAIRE-analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den HyCCAPP metod som beskrivs här har många unika funktioner som gör det en kraftfull metod att avslöja DNA-interaktioner som annars skulle förbli svårfångade. Processen ger HyCCAPP flexibiliteten att arbeta i olika organismer och regioner i genomet. Det är en metod, men som har flera begränsningar beaktas.
HyCCAPP är en metod som undviker ändringar cellen så att den kan potentiellt tillämpas i primära celler, kultur cellsystem eller ens vävnadsprover. På grund av detta, men k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av NIH Grants P50HG004952 och R01GM109099 till MO.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
