Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

Summary

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Abstract

La capture de l’hybridation des protéines associées à la chromatine de technologie protéomique (HyCCAPP) a été initialement développée pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine dans la levure. Il permet l’analyse d’une zone cible d’intérêt sans besoin de connaissances préalables sur les protéines probables lié à la région cible. Ceci, en théorie, permet HyCCAPP à utiliser pour analyser n’importe quelle région génomique d’intérêt, et il fournit suffisamment de souplesse pour travailler dans les systèmes cellulaires différentes. Cette méthode n’est pas destinée à étudier des sites de liaison connue des facteurs de transcription, une tâche mieux adaptée à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et les méthodes de type puce. La force de HyCCAPP réside dans sa capacité à explorer des régions d’ADN pour lesquels il existe peu ou aucune connaissance sur les protéines lié à elle. Il peut également être une méthode pratique pour éviter les biais (présent dans la puce comme méthodes) introduits par un enrichissement de la chromatine à base de protéines en utilisant des anticorps. Potentiellement, l’HyCCAPP peut être un outil puissant pour découvrir véritablement nouvelles interactions ADN-protéines. A ce jour, la technologie a été principalement appliquée aux cellules de levure ou de séquences répétées de copie élevée dans les cellules de mammifères. Pour devenir un outil puissant que nous envisageons, HyCCAPP approches doivent être optimisées pour capturer efficacement les loci de l’exemplaire unique dans les cellules de mammifères. Ici, nous présentons notre adaptation de la levure initiale HyCCAPP protocole de lignées cellulaires humaines de capture et montrent que les régions de chromatine exemplaire unique peuvent être efficacement isolées avec ce protocole modifié.

Introduction

Au cours de la dernière décennie, il a vu une amélioration spectaculaire des technologies de séquençage, ce qui permet l’étude d’un large éventail des génomes dans un grand nombre d’échantillons et avec une résolution étonnante. Le Consortium de l’Encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder), un effort de plusieurs établissement à grande échelle mené par le National Human Genome Research Institute de la National Institutes of Health, a permis de mieux comprendre comment les facteurs de transcription et autres protéines régulatrices lient à et d’interagissent avec le génome. L’effort initial caractérise les interactions ADN-protéines spécifiques, tels qu’évalués par im....

Protocol

1. capturer oligonucléotide Design

1. Concevoir un panneau d’oligonucléotides à utiliser lors de la prise de l’hybridation de la région cible/s.
   1. Visent à concevoir des oligonucléotides de 4 à 8 par région cible, mais au moins, au moins un oligonucléotide ciblant chaque extrémité de la région cible de conception.
   2. Si la séquence cible est longue (> 500 paires de bases), concevoir les oligonucléotides comme étalé que possible pour assurer l’enrichissement efficace de la chromatine dans toute la région de l’ensemble de la cible.
      NOTE : Nous avons observé une capture optimale avec des oligonucléotides de 4 – 8. Même si ce pr....

Results

En raison de la nécessité pour les grandes quantités d’entrée de la chromatine de HyCCAPP réussir, les cellules sont cultivées à des niveaux relativement élevés de confluence. Trypan coloration bleu est utilisée pour confirmer que le taux de mort cellulaire sont modérés (< 10 %). Dans les expériences de l’exemplaire unique, contenu de chromatine avant l’hybridation capture doit être dans la plage de femtomolar, qui exige habituellement au moins 10⁹ cellules comme matériau de.......

Discussion

La méthode HyCCAPP décrite ici a plusieurs caractéristiques uniques qui en font une approche puissante pour découvrir les interactions ADN-qui resteraient autrement insaisissables. La nature du processus donne HyCCAPP la possibilité de travailler dans divers organismes et régions du génome. Il s’agit d’une méthode, mais qui a plusieurs limites à prendre en considération.

HyCCAPP est une méthode qui évite toute modification de la cellule afin qu’il peut potentiellement être appliqué dans les ce.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Outil PrimerQuest	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT		Analyser les oligonucléotides de capture
PairFold	UBC		Analyser les interactions
RPMI 1640 média	Thermo Fisher	11875093
Pénicilline-streptomycine	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine  ;	Thermo Fisher	25030081
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher	26140079
Compteur de cellules automatisé	Thermo Fisher
850 cm2 flacon roulant	Greiner Bio-one	680058
Système de rouleaux	Wheaton	22-288-525
37 % formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F8775
Glycine	Sigma-Aldrich
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
Cocktail inhibiteur de protéase	Sigma-Aldrich	P4380
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Branson sonificateur numérique SFX 150	Emerson
Qubit 3.0 fluorimètre	Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR kit de dosage	Thermo Fisher	Q32850
Bioanalyseur 2100	Agilent
Agilent DNA 1000 kit	Agilent	5067-1504
MES sel de sodium	Sigma-Aldrich	M3885
NaCl 5M	Thermo Fisher	AM9760G
EDTA	Aimant Sigma-Aldrich
DynaMag-2	Thermo Fisher	12321D
Aimant DynaMag-15 Thermo	Fisher	12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin	Thermo Fisher	60210
Tubes à faible liaison	Eppendorf	22431081
Four d’hybridation	SciGene
Agitateur de tube et rotateur	Thermo Fisher	415110Q
DNase I (sans RNase)	New England BioLabs	M0303
Tampon SSC 20×	concentré Sigma-Aldrich	S6639