Déterminer si l’ADN colorées avec un Cyanine colorant peuvent être digérées par les Enzymes de Restriction

Résumé

Coloration des molécules d’ADN pour la microscopie de fluorescence permet de les visualiser au cours d’une expérience scientifique. Dans la méthode présentée ici, les molécules d’ADN sont pré-teint avec les colorants fluorescents et digérés par méthylation et enzymes de restriction sensibles non-méthylation.

Résumé

Visualisation de l’ADN pour la microscopie de fluorescence utilise une variété de colorants tels que colorants cyanine. Ces colorants sont utilisés en raison de leur grande affinité et la sensibilité pour l’ADN. Afin de déterminer si les molécules d’ADN pleine longueur à l’issue de l’expérience, une méthode est nécessaire pour déterminer si les molécules colorées sont pleine longueur par digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction. Cependant, teinté d’ADN peut inhiber les enzymes, si une méthode est nécessaire pour déterminer quelles enzymes on peut utiliser pour fluorochrome ADN coloré. Dans cette méthode, l’ADN est coloré avec un colorant cyanine pendant la nuit pour permettre au colorant et l’ADN de s’équilibrer. Prochaine, vitrail de l’ADN est digéré par une enzyme de restriction, chargé un gel et PST1. Les bandes de digérer l’ADN expérimentales sont comparés à un digest en silico pour déterminer l’activité de l’enzyme de restriction. S’il y a le même nombre de bandes comme prévu, la réaction est terminée. Plus de bandes que prévu indiquent une digestion partielle et moins bandes indiquent une digestion incomplète. L’avantage de cette méthode réside dans sa simplicité, et il utilise un équipement qui aurait besoin d’un scientifique pour une enzyme de restriction de dosage et électrophorèse sur gel. Une limitation de cette méthode est que les enzymes disponibles pour la plupart des scientifiques sont disponibles dans le commerce ; Cependant, les enzymes de restriction pourrait être utilisés.

Introduction

La série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, 3-YOYO, POPO-3 et BOBO-3 ; Le tableau 1) est utilisé dans une grande variété d’expériences où la visualisation de l’ADN est nécessaire^{1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ,}

Protocole

1. préparation de colorants, de tampons et de Gel d’Agarose

1. Préparer les solutions suivantes pour la coloration de l’ADN ou la digestion de l’ADN tachée.
   1. Préparer 1 x TE (Tris-HCl et EDTA acide ; Tampon à l’EDTA) aide 10 mM Tris-HCl et 1 mM d’EDTA dans un cylindre gradué ou une fiole jaugée. Conserver à température ambiante (18-25 ° C).
   2. Faire des parties aliquotes de chaque colorant : TOTO-1, YOYO-1, 1-POPO, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tableau 1). Distribuer 4 µL de colorant de 1 mM dans un ambre foncé ou noir 1,5 tube de mL et ajouter 36 µL de 1 x TE, mélanger à l’aide de la pipette ; Cette concentration pe....

Résultats

Afin de déterminer que si un colorant intercalant affectera une enzyme de restriction digestion de l’ADN, l’ordre correct des étapes doit être suivies (Figure 1). Une fois que l’ADN est tachée et digéré par une enzyme donnée, une image du gel peut être prise pour déterminer le nombre de fragments et leur taille (Figure 2). Afin de déterminer l’efficacité de l’enzyme, le nombre total de bandes visibles attendues, divisé par le nom.......

Discussion

Pour digérer l’ADN fluorescent étiquetés (Figure 1), une série d’étapes sont nécessaires. Tout d’abord, l’ADN est taché avec un fluorochrome du jour au lendemain. L’ADN peut être incubée avec dimères de cyanine pendant une courte période de temps ; Cependant, Carlsson et al a conclu que les ADN créé doubles bandes pour chaque taille d’ADN en raison de la coloration incomplète²⁰. Pour remédier à cela, l’ADN peut être coloré au jour le jour pou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ADN lambda non méthylé	NEB	N3013S
YOYO-1	ThermoFisher Scientific	Y3601
TOTO-1	ThermoFisher Scientific	T3600
POPO-1	ThermoFisher Scientific	P3580
BOBO-1	ThermoFisher Scientific	B3582
YOYO-3	ThermoFisher Scientific	Y3606
TOTO-3	ThermoFisher Scientific	T3604
POPO-3	ThermoFisher Scientific	P3584
BamHI	NEB	R0136S
PmlI	NEB	R0532S
ScaI	NEB	R3122S
EcoRI  ;	NEB	R0101S
HindIII	NEB	R0104S
SmaI	NEB	R0141S
Tris	Fisher	BP152-1	Irritant
EDTA	Fisher	S316-212
HCl	toxique Fisher	S25358	Tampon corrosif et irritant
1	NEB	B7201S	NEB 1.1
Buffer 2	NEB	B7202S	NEB 2.1
Buffer 3	NEB	B7204S	NEB Cutsmart
Gel d’agarose à haute température de gélification	Lonza	50041
Acetic Acid	Fisher	S25118	Hazardous
Blue light transilluminator	Dark Reader	DR196	Portez des lunettes correctes  ;
Le bromure d’éthidium	Fisher	15585011	cancérigène ; d’autres alternatives sont Nancy 520, Gel red, etc.
Canon EOS Rebel T3I appareil photo	Canon
Apogee Modèle H4	Biorad	1704510
Power Pac Alimentation de base	Biorad	1645050  ;
Ficoll	Fisher Scientific	BP525-25
Bleu de bromophénol	Fisher Scientific	B-392
Xylène Cyanol	Eastmen	T1579