En Optogenetic metode til at styre og analysere gen Expression mønstre i celle-til-celle interaktioner
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at analysere celle til celle overførsel af oscillerende oplysninger optogenetic kontrol og live overvågning af genekspression. Denne fremgangsmåde giver en enestående platform for at teste en funktionel betydning af dynamiske gen expression programmer i flercellede systemer.
Abstract
Celler bør reagere korrekt på tidsligt skiftende miljøer, som påvirkes af forskellige faktorer fra de omkringliggende celler. Notch signalering pathway er en af sådanne væsentlige molekylære maskineri til celle-til-celle kommunikation, som spiller vigtige roller i den normale udvikling af embryoner. Denne vej indebærer en celle til celle overførsel af oscillerende oplysninger med ultradian rytmer, men trods fremskridt i molekylærbiologiske teknikker, har det udfordrende for at belyse virkningerne af flercellede interaktioner på oscillerende gen Dynamics. Vi præsenterer her, en protokol, der tillader optogenetic kontrol og live overvågning af gen expression mønstre tidsmæssige præcist. Denne metode afslørede med held at intracellulære og intercellulære periodiske indgange af Notch signalering entrain iboende svingninger af frekvens tuning og fase skiftende den encellede opløsning. Denne fremgangsmåde gælder for analysen af de dynamiske funktioner i forskellige signaling veje, giver en unik platform for at teste en funktionel betydning af dynamiske gen expression programmer i flercellede systemer.
Introduction
Celle-til-celle kommunikation spiller en kritisk rolle i embryonale mønstre i udviklingsprocesser. Hvirveldyr embryoner udgøres de metameriske strukturer, der kaldes somites langs anterior-posterior krop akse med en præcis tidsmæssige nøjagtighed under kontrol af en tid-holder ur, kaldet segmentering uret1. Under denne proces, en gruppe af presomitic mesoderm (PSM) celler regelmæssigt omdannes til somites i en synkron måde. Denne proces indebærer synkroniserede oscillerende genekspression og PSM celler, der svinger i fase udgør de samme somites. Perioden i den oscillerende genekspression er omkring 2 til 3 timer i mus og ca 30 min i zebrafisk. Når adskilles, PSM celler mister synchrony2,3, men når de er re aggregerede, de kan selv organisere og gendanne den befolkning synchrony4, tyder på, at celle-celle kobling er en nøgle til den synkroniserede svingninger.
Omfattende indsats afslørede, at signaling molekyler i Delta-Notch pathway er tæt forbundne til synkroniserede svingninger af segmentering ur gener. Enten farmakologiske hæmmere eller genetiske mutationer af Notch signalering desynchronize befolkningen i oscillatorer. Mutanter af Notch signalering komponenter, såsom DeltaC, DeltaD og Notch1a, vist i zebrafisk, asynkron svingninger5,6. Med kylling eller mus embryoner er ikke kun Notch ligand Delta-lignende1 (Dll1), men også Notch Modulator Lunatic fringe (Lfng) påkrævet for synkroniseret svingninger7,8,9. Men det har været svært at teste den funktionelle kapacitet af sådanne molekyler til dynamisk informationsoverførsel fra celle til celle, fordi tidsmæssige resolutioner af konventionelle undertrykkelse af netbårne gen forordning dynamik ikke var tilstrækkelige til at undersøge de processer af tidsskalaer af 2-3 h (ultradian rytmer).
Vi har for nylig udviklet en integreret metode til at kontrollere og overvåge gen expression mønstre i pattedyrceller10. Denne teknologi gør det muligt for induktion af gen expression pulser af periodiske lys belysning på ultradian tid-skalaer. Denne protokol repræsenterer metoder at etablere lysfølsomme cellelinjer og observere dynamisk svar af reporter celler af live-celle luminescence overvågning i sammenhænge af celle-til-celle kommunikation. Denne metode gælder for analysen af mange andre signaling veje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viste en metode til at styre gen expression dynamics med en hyppighed på 2 til 3 h. Denne tidshorisont er meget kortere end dem i andre konventionelle systemer, herunder Tet-On-system og den oprindelige Niels. Vigtige parametre til at nå de ultradian tidsskalaer er halveringstider foto-induceret molekylære produkter, mRNAs og proteiner. Disse kinetiske parametre kan afhænge af celletyper og arter. For tuning forsvindingskinetik, er erstatter Hes1 3′ UTR sekvenser med andre en straight-forward måde, fordi det ikke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af JST, PRESTO (AI), Core forskning for Evolutional videnskab og teknologi (JPMJCR12W2 (Lisbeth)), licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Undervisningsministeriet, kultur, sport, videnskab og teknologi (MEXT), Japan 26119708 (AI) og 16 H 06480 (Lisbeth)), videnskabelig forskning (et) (Japan samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) 24240049 (Lisbeth)), og unge forskere (A) (JSP’ER 15 H 05326 (AI)), og en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder “fluorescens Live imaging”MEXT, Japan og Platform for dynamiske tilgange til levende System fra MEXT, Japan.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
