Traditionelle metoder til vurdering af adipogenic differentiering er billig og nem at bruge, men er ikke specifikke for ændringer i genekspression. Vi har udviklet en analyse for at kvantificere mesenchymale Celledifferentiering af modne adipocytter ved hjælp af en slægt specifikke markør. Denne analyse har forskellige programmer på tværs af grundforskning og klinisk medicin.
Flere farvestoffer er i øjeblikket tilgængelig for brug i forbindelse med afsløring differentiering af mesenchymale celler adipocytter. Farvestoffer, såsom olie røde O, er billig, nem at bruge og bredt udnyttet af laboratorier, der analyserer adipogenic potentialet af mesenchymale celler. De er imidlertid ikke specifikke ændringer i genet transskription. Vi har udviklet en gen-specifikke differentiering analyse til at analysere når en mesenchymale celler har skiftet sin skæbne til en adipogenic afstamning. Immuno-mærkning mod fedtsyre bindende protein-4 (FABP4), en slægt-specifikke markør for adipogenic differentiering, aktiveret visualisering og kvantificering af differentierede celler. Evnen til at kvantificere adipogenic differentiering potentiale af mesenchymale celler i en 96 godt mikrotiterplade format har lovende konsekvenser for en række applikationer. Hundredvis af kliniske forsøg indebærer brug af voksne mesenchymale stromale celler og er det i øjeblikket vanskeligt at korrelere terapeutiske resultater inden for og især mellem sådanne kliniske forsøg. Denne enkle høj overførselshastighed FABP4 analyse giver en kvantitativ analyse til vurdering af patient-afledte celler differentiering potentiale og er en robust værktøj til at sammenligne forskellige isolation og udvidelse metoder. Dette er især vigtigt i betragtning den stigende anerkendelse af heterogenitet af de celler, der administreres til patienter i mesenchymale celler produkter. Analysen har også potentielle nytte i høj overførselshastighed stof screening, især i fedme og præ-diabetes forskning.
En af de vigtigste krav fastsat af det internationale samfund for cellulære terapi (ISCT) til at definere en Multipotente mesenchymale stromale celle er, at cellerne skal have mulighed for at differentiere i adipogenic, osteogenic og chondrogenic slægter 1. konventionelle metoder til måling af differentiering af disse tre slægter stole på påvisning af makromolekylære produkter ved hjælp af kemiske farvestoffer1. Farvestoffer såsom olie røde O (som pletter fedt dråber i celler, der har undergået adipogenesis), er billig og nem at bruge; men de undlader at registrere de specifikke ændringer i genekspression, der opstår, når mesenchymale celler differentiere i hver respektive lineage2. Her, har vi udviklet en differentiering assay, der kvantificerer protein udtryk for en adipogenic slægt-specifikke markør, fatty syre-bindende protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 blev oprindeligt fundet i murine 3T3-L1 adipocytter3 og blev senere opdaget skal udtrykkes i menneskelige subcutan fedtvæv6. Det er en cytosole protein, der fungerer som en anstandsdame til at guide fedtsyre optagelse af celler og er involveret i processen med lipolyse4.
De forløber celler til differentiering assays blev fedt afledt mesenchymale stromale celler (ASCs)7,8. ASCs deler mange egenskaber med knoglemarv-afledte mesenchymale stamceller (BM-msc), en større mesenkymale stamceller befolkning i voksne8,9. ASCs tilbyder flere fordele i forhold til BM-MSCs i en klinisk anvendelse, som større udbytte af celler kan isoleres fra mere lettilgængelig væv kilder8,9. En isoleret celle befolkning skal opfylde visse kriterier, der defineres som ASCs. Først, skal de vise overholdelse af plast vævskultur fartøjer i standard kultur betingelser1. De skal også vise specifikke overflade antigen udtryk1. Ukultiveret ASCs er kendetegnet ved positiv overflade antigen udtryk for CD34, CD73, CD90, lav udtryk for CD105 og negative udtryk for CD45 og HLA-DR10. ASCs renset ved dyrkning på plastik i 28 dage (tilhænger renset ASCs) vise positive udtryk for CD73, CD90 og CD105 og negative udtryk af CD34, CD45 og HLA-DR10. Endelig skal celler bevare muligheden for at differentiere i forskellige lineages1,7,8.
Adipogenic differentiering protokoller fremkalde slående opregulering af FABP4 udtryk blandt andre adipocyt lineage gener, så vi brugte immunochemistry for at visualisere FABP4 protein i cellerne, og derefter kvantificeret FABP4 udtryk på enkelt celle-niveau ved hjælp af en automatiseret Fluorescerende høj-indhold screening mikroskop. Denne metode er fordelagtige over traditionel farvestoffer, da det giver mulighed for meget specifikke bekræftelse af adipocyt-lineage differentiering. Sådanne gen specifikke lineage assays kombineret med højt indhold af screening-metoder også aktiverer kvantificering af andelen af celler i en heterogen celle forberedelse, der er i stand til at differentiering ned en bestemt slægt. I vores undersøgelser brugte vi FABP4 analysen for at bekræfte tab af adipogenic differentiering potentiale af frisk isolerede ASCs efter cellekultur.
Dette papir viser nytte og fordele af FABP4 immunolabelling til præcist at detektere og kvantificere modne adipocytter afledt af mesenchymale stromale celler. FABP4 er købedygtig opdager ændringer i udtryk et lineage specifikke protein3,,4,5 i modne adipocytter, i strid med andre almindeligt anvendte farvestoffer som etiket makromolekylære ændrer13,14 olie røde O15, Nile rød16 og Sudan sort17. FABP4 immunolabelling giver mulighed for visualisering og analyse af ændringer i cellulære morfologi. Dette er en markant fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder ved hjælp af kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR), der analyserer ændringer på udskrift plan uden nogen visualisering5,18,19 ,20, eller flowcytometri, der kræver celler i suspension20eller Western blotting der kræver celler til at være mængden for at isolere protein19,20. FABP4 immunolabelling er stabilt i faste celler, sive ikke ud i løsning og at være en cytosole protein når mærket i en vedhængende éncellelag af celler, vil overlappe kerne giver mulighed for nem visualisering og tilføjet nøjagtighed i den automatiserede analyse.
High-indhold screening er fordelagtig, fordi den er hurtig, nøjagtig, reproducerbare og objektive. Det giver en platform for omkostningseffektiv brug af reagenser og forsker tid, da billede erhvervelse og analyse kræver minimal manuel manipulation og stole på den automatiske behandling af instrumentet. Flere faktorer blev identificeret som kritiske nøjagtigheden og reproducerbarhed af high-indhold screening-undersøgelser,31. Kvantificering af antigen udtryk er afhængig af billedkvaliteten. For vellykket billedanalyse, billeder fra hver kanal pr. brønd skal være i fokus og falder inden for en optimal dynamikområde til grå værdier (Auto afsløre indstillinger er ideel). Ud af fokus eller mættede billeder føre til fejlagtige resultater.
Nogle potentielle begrænsninger af de metoder, der beskrives i denne artikel omfatter følgende. Krav til specialiseret imaging udstyr og analyse software. Mens uden for anvendelsesområdet for denne artikel, kan alternative open source software muligheder (for eksempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) bruges til at udføre lignende billedsegmentering opgaver; men de kræver færdigheder enten hente og skræddersy makroer tilgængelig online eller skrive makroer/kommandoer for deres specifikke analyse rørledninger. Iboende til alle automatiske imaging analyse rørledninger er et niveau af baggrundsstøj. Dette kan i vid udstrækning tilskrives vragrester, dårlig billede kvalitet eller analyse fejl, understreger behovet for omhyggelig prøveforberedelsen og omhyggelig opsætning af billedbehandling og analyse-platformen. FABP4 etiket i mus er blevet fundet for at opdage udifferentierede stamfaderen30; mens kontrolelementerne i denne undersøgelse (som består af udifferentierede celler) er blottet for specifikke FABP4 farvning. Denne manglende scores nødvendigheden af kontrol FABP4 udtryk udifferentierede ophav i hver biologisk kontekst hvor analysen er ansat.
For at drage gyldige sammenligninger mellem FABP4 mærkning og olie røde O farvning, output målinger fra billedanalyse skulle være biologisk relevante. Derfor, måling, ‘% positive celler’ blev brugt til FABP4, og ‘område af farvning pr. celle’ blev brugt til olie røde O. Det er bemærkelsesværdigt, at foranstaltning ‘% positive celler’ ikke blev brugt til olie røde O mærket celler i vores undersøgelse, fordi det ikke var muligt at tilskrive de mærkede fedt dråber præcist til en given kerne; de fedt dråber varierede betydeligt i størrelse, antal og fordeling på tværs af cellen kroppen og sjældent overlappede med kernen. Olie røde O farvning variation der findes mellem celler, der stammer fra forskellige væv kilder; mens % positive celler foranstaltning ikke var egnet til den igangværende undersøgelse, en anden gruppe har brugt det med succes for at kvantificere adipocytter stammer fra menneskelige kirtel stamceller22 hvor olie røde O farvning optrådte som en stor fedt droplet, som strakte sig over de cytoplasma og overlappede med kerner og gør det muligt data der skal fremlægges som % positive celler.
Derimod er morfologi af FABP4 immunolabelling konsekvent i adipocytter stammer fra en række forskellige væv kilder23,24,25. Evnen til at kvantificere andelen af celler i en kultur, der er i stand til at differentieringen har en række anvendelser. Voksen mesenchymale stromale celler holder betydelig lovende for en bred vifte af terapeutiske anvendelsesmuligheder. Et vigtigt spørgsmål, som er opstået med kliniske oversættelse er den iboende variation i evne til disse celler mellem patienter26, mellem lokaliteter af isolation27,28, og mellem metoder til isolering12 og udvidelse af celle numre12 til terapeutisk brug. Det har været vist tidligere kulturer af vedhængende stromale celler er ofte heterogene, med nogle celler i stand til differentiering og nogle ikke 12,17 som vores FABP4 analysen viser for ASC kulturer. Undersøgelser, som dette, kombineret med berigelse teknikker, vil hjælpe med at identificere delpopulationer i heterogene kulturer kan afstamning-specifikke differentiering. At have en standardiseret, kvantificerbare assay som denne FABP4 assay indeholder en enkel metode til sammenligning mellem alle disse variabler, og potentiale til at evaluere terapeutiske resultater inden for og mellem kliniske forsøg.
Kvantificering af FABP4 i en semi-automatiseret måde giver objektivitet og reproducerbarhed i analyse på tværs af mange donor sager og prøver. Desuden som etiketten er cytoplasmatisk, kan det potentielt blive anvendt til at analysere hypertrofi (udvidelse af adipocyt størrelse) ud over hyperplasi (stigning i adipocyt række), en sondring, der er af stor betydning i fedme forskning, hvor hypertrofi er stærkt forbundet med fedt dysfunktion i fede personer21. Fedmeepidemien har ansporet en betydelig interesse i at identificere stoffer i stand til at kontrollere lipid opbevaring. Denne FABP4 analyse giver også en enkelt udlæsning til screening af tusindvis af forbindelser for deres evne til at hæmme lipid ophobning.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for donorer af fedtvæv og forskning fagfolk, der indsamler og giver os denne ressource for forskning brug. Vi vil gerne anerkende finansieringen støtte af Allergan. Vi er også taknemmelige til University of Auckland, Faculty of Medical og Health Sciences ydeevne baseret forskning Fund for finansiering af omkostningerne ved videoing og redigering for indgivelse af denne artikel.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |