यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए आक्रामक aspergillosis के साथ चूहों में फुफ्फुसीय कवक बोझ निर्धारित करने के लिए है Gomori संशोधित methanamine ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में दाग चांदी के ठहराव द्वारा । इस विधि का उपयोग कम पशुओं के साथ तुलनीय परिणाम के परिणामस्वरूप कवक बोझ के आकलन की तुलना में फेफड़ों कवक डीएनए की मात्रात्मक पीसीआर ।
फेफड़े कवक बोझ के ठहराव फेफड़े कवक संक्रमण के माउस मॉडलों में प्रतिरक्षा सुरक्षा और कवक डाह के सापेक्ष स्तर के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि कई तरीकों कवक बोझ का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (कवक डीएनए के qPCR) पिछले संस्कृति पर कई फायदे के साथ एक तकनीक के रूप में उभरा है आधारित तरीकों । वर्तमान में, फेफड़ों की विकृति का एक व्यापक आकलन, ल्युकोसैट भर्ती, कवक बोझ, और आक्रामक aspergillosis के साथ चूहों में जीन अभिव्यक्ति (IA) प्रयोगात्मक और नियंत्रण जानवरों की एक महत्वपूर्ण संख्या का उपयोग आवश्यक. यहां फेफड़ों ऊतकवैज्ञानिक के ठहराव को कवक बोझ पशुओं की एक कम संख्या का उपयोग निर्धारित करने के लिए विस्तार से जांच की थी । फेफड़ों के वर्गों के लिए है Gomori संशोधित methanamine चांदी (ग्राम) धुंधला के साथ कवक संरचनाओं की पहचान दाग रहे थे । छवियों को ग्राम से लिया गया था-एक formalin के 4 असतत क्षेत्रों से दाग वर्गों-फिक्स्ड आयल-फेफड़े एंबेडेड । प्रत्येक छवि के भीतर ग्राम दाग क्षेत्रों quantified एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग कर रहे थे, और इस ठहराव से, दाग क्षेत्र का मतलब प्रतिशत प्रत्येक नमूने के लिए निर्धारित किया गया था । इस रणनीति का प्रयोग, eosinophil की कमी चूहों की कमी कवक बोझ और caspofungin चिकित्सा के साथ रोग का प्रदर्शन, जबकि IA के साथ जंगली प्रकार चूहों caspofungin के साथ सुधार नहीं किया । इसी तरह, γδ टी कोशिकाओं की कमी चूहों में कवक बोझ भी caspofungin द्वारा सुधार किया गया, के रूप में qPCR और ग्राम ठहराव द्वारा मापा. ग्राम ठहराव इसलिए सापेक्ष फेफड़ों कवक बोझ के निर्धारण के लिए एक विधि के रूप में शुरू की है कि अंततः प्रयोगात्मक इनवेसिव aspergillosis के व्यापक अध्ययन के लिए आवश्यक पशुओं की मात्रा कम हो सकती है ।
आइए एक अवसरवादी संक्रमण है कि अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में जन्मजात के साथ विकसित हो सकता है या प्रतिरक्षा दमन चिकित्सा या जीर्ण संक्रमण के कारण इम्यून की कमी1,2. प्राथमिक संक्रमण अक्सर फेफड़ों में होता है, हालांकि जिगर, गुर्दे, दिल, और मस्तिष्क के लिए Aspergillus fumigatus के कुछ उदाहरणों के प्रसार में हो सकता है, गंभीर रोग और उच्च के साथ hyphae के व्यापक ऊतक आक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर1,2। इसके अलावा, मौजूदा pharmacotherapies की प्रभावकारिता सीमित है, और आगे के वातावरण में रोधी प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के द्वारा कमजोर हो सकता है3. इसलिए कवक डाह और मेजबान विकृति है कि विकास या आक्रामक कवक रोग के गहरा को बढ़ावा देने के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है ।
Murine मॉडल यंत्रवत IA अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण रहते हैं, के रूप में वे की स्थापना और vivo4,5 में A. fumigatusकी वृद्धि के लिए कवक डाह जीन और मेजबान प्रतिरक्षा प्रभाव की भूमिकाओं का आकलन करने के लिए शोधकर्ताओं की अनुमति । नतीजतन, कई रणनीतियों के लिए प्रभावी ढंग से यों तो या प्रयोगात्मक पशुओं के समूहों में कवक बोझ की तुलना करने के लिए तैयार किया गया है6,7। इन रणनीतियों को शामिल संस्कृति आधारित, जैव रासायनिक, immunoassay, या qPCR तरीकों, अलग फायदे और नुकसान के साथ एक । इसके अलावा, इन तरीकों में से प्रत्येक प्रतिरक्षा प्रभाव समारोह के आकलन के लिए बलिदान उन लोगों के अलावा पशुओं का एक सबसेट के समर्पण शामिल, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, और तुलनात्मक histopathology7। इस प्रकार, व्यापक IA अध्ययन अक्सर एक महत्वपूर्ण कीमत पर अनुसंधान पशुओं की महत्वपूर्ण संख्या की आवश्यकता है । प्रभावी रणनीति है कि प्रयोगात्मक समय, पशु लागत को कम करने, और कई विश्लेषण के लिए पशु ऊतकों का उपयोग करके नैतिक विचार इसलिए बहुत मूल्यवान है7।
इस रिपोर्ट में, एक विधि का वर्णन ठहराव के साथ चूहों के प्रयोगात्मक समूहों के बीच रिश्तेदार कवक बोझ की तुलना के लिए ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में दाग की शुरुआत की है । कवक संस्कृति से संक्रमण के लिए हर कदम, ऊतक फसल और प्रसंस्करण, और छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण, विस्तार से वर्णन किया गया है । ग्राम ठहराव द्वारा प्राप्त कवक बोझ ia के neutropenic मॉडल में qPCR के साथ तुलना की गई थी, और ia8के साथ caspofungin-इलाज जंगली-प्रकार या eosinophil की कमी चूहों में । परिणाम ग्राम ठहराव और कवक डीएनए के qPCR के साथ समानता दिखा । यह पता चलता है कि ग्राम ठहराव ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण में लगे शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है एक पूरक या वैकल्पिक विधि के रूप में चूहों में रिश्तेदार कवक बोझ की तुलना के IA के साथ, और अंततः लागत और अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को कम कर सकते हैं कॉम्प्लेक्स, यंत्रवत स्टडीज.
इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए IA के साथ चूहों में फेफड़े कवक बोझ के निर्धारण के लिए एक विधि परिचय ग्राम-दाग फेफड़ों ऊतकवैज्ञानिक छवि विश्लेषण और ठहराव के लिए वर्गों था । इस अध्ययन में, β-glucan-संश्लेषण-लक्ष्यीकरण रोधी दवा caspofungin के साथ उपचार14 IA8के साथ neutropenic जंगली प्रकार चूहों में अस्तित्व या फंगल बोझ में सुधार नहीं किया. हालांकि, इयोस्नोफिल्स या γδ टी कोशिकाओं के अभाव में, अस्तित्व और कवक बोझ में सुधार । हमारे अध्ययन के परिणाम भी दिखा दिया है कि तुलनीय परिणाम व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कवक डीएनए qPCR विधि6की तुलना में ग्राम कवक बोझ से प्राप्त किया जा सकता है ।
वहां ग्राम कवक बोझ ठहराव का उपयोग करने के लिए कई लाभ हैं । सबसे पहले, इस प्रक्रिया के मौजूदा ऊतकवैज्ञानिक नमूनों का उपयोग कर सकते हैं, इस प्रकार संभावित प्रयोगों की संख्या को कम करने के लिए महत्वपूर्ण मतभेदों को निर्धारित करने की आवश्यकता है । दूसरा, इस अध्ययन में, कम जानवरों के लिए आवश्यक थे ग्राम कवक बोझ ठहराव कवक डीएनए की qPCR की तुलना में महत्वपूर्ण मतभेदों को प्राप्त करने के लिए (चित्रा 6, चित्रा 7). तीसरा, फंगल बोझ की तुलना में अलग qPCR द्वारा पृथक-निर्भर अंतर से प्रभावित हो सकता है राइबोसोमल डीएनए प्रतिलिपि संख्या15में । इसके विपरीत, ग्राम ठहराव कॉपी संख्या से प्रभावित नहीं है, के रूप में कवक बोझ फेफड़ों कवक विकास के सापेक्ष स्तर से निर्धारित होता है । इस प्रकार, कवक बोझ के लिए ग्राम ठहराव का उपयोग हड्डीवाला पशुओं के उपयोग को कम करता है और rDNA कॉपी संख्या के पूर्व निर्धारण की आवश्यकता नहीं है । अंत में, फंगल आकृति विज्ञान को संशोधित करने के अलावा, caspofungin थेरेपी कवक विखंडन बढ़ जाती है, और इस प्रकार कृत्रिम रूप से कवक बोझ बढ़ सकता है, जब फेफड़ों से कॉलोनी बनाने इकाइयों के अलगाव से मापा homogenates12,16 ,17. इस प्रकार, कवक बोझ के ग्राम ठहराव कई अंय आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों के साथ निहित सीमाओं से बचा जाता है ।
हालांकि, ग्राम ठहराव और/या इस अध्ययन की सीमाएं नोट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, लेखकों प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के फेफड़ों भर में hyphal विकास के एक तुलनीय वितरण ग्रहण, और इस प्रकार पूरे फेफड़ों में कवक बोझ के लिए एक प्रतिनिधि माप के रूप में 4 प्रतिनिधि 10x उद्देश्य क्षेत्रों से ठहराव का इस्तेमाल किया (चित्रा घमण्ड). यह संभव है कि कुछ उदाहरणों में सापेक्ष वितरण, आकार, और hyphal घावों के घनत्व पर्याप्त रूप से अलग है ताकि कवक बोझ इस विधि और qPCR विधि द्वारा समकक्ष के साथ अलग दिखाई देगा । हालांकि, पूरे फेफड़े अनुभाग के साथ हमारे अतिरिक्त परिणाम ठहराव 4x उद्देश्य क्षेत्रों का उपयोग कर इसी तरह, कम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण यद्यपि, समूहों के बीच मतभेद (चित्रा 6C) दिखाया । इस ठहराव की मानक त्रुटि इस रणनीति के साथ वृद्धि हुई, की संभावना 4x उद्देश्य के साथ कम hyphal संकल्प के कारण और उपइष्टतम क्षेत्रों में पृष्ठभूमि में वृद्धि हुई थी । इसलिए, अधिक आवर्धन पर कम फ़ील्ड्स का प्रतिनिधि ठहराव पसंद की जाती है । दूसरा, केवल एक एकल, केंद्रीय अनुभाग प्रत्येक नमूने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह संभव है, कवक अलग या चूहों इस्तेमाल किया उपभेदों के आधार पर, कि कुछ अध्ययनों से hyphal वृद्धि का एक असमान वितरण में परिणाम हो सकता है । उन उदाहरणों में, प्रत्येक तेल ब्लॉक भर में अतिरिक्त वर्गों के लिए एक अधिक प्रतिनिधि बोझ प्राप्त quantified होना चाहिए । तीसरा, प्रयोगों में है कि mucins (यानी, एलर्जी bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 या सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)18), ग्राम जेट में airway कवक विकास को बढ़ाता है के पर्याप्त उत्पादन के साथ polysaccharide-रिच mucins19 गैर विशिष्ट ग्राम + परिणाम उपज सकता है और इस प्रकार उच्च कवक बोझ के पक्ष में कुछ नमूनों विषम । IA के केवल neutropenic मॉडल के बाद से इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था, यह संभव है कि अंय प्रतिरक्षा सक्षम या दबा मॉडल का उपयोग कम तुलनीय परिणामों में परिणाम सकता है । इन निरंतर के बावजूद, ग्राम ठहराव कवक बोझ का निर्धारण करने के लिए एक तुलनीय तकनीक प्रदान करता है, और इसके अतिरिक्त अध्ययन में जारी उपयोग आगे संगत, विश्वसनीय, और लागत प्रभावी के रूप में इस विधि की उपयोगिता को मांय कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन के भाग में एक इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा अनुसंधान संवर्धन अनुदान के स्कूल द्वारा और NIH-NIAID 1R03AI122127-01 द्वारा समर्थित किया गया था । एनए आंशिक रूप से Immunologists के अमेरिकन एसोसिएशन से इम्यूनोलॉजी फैलोशिप में एक कॅरिअर द्वारा इस अवधि के दौरान समर्थित था ।
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |