Dreidimensionale entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva
Summary
Das Ziel des Protokolls ist eine entzündliche menschlichen Gingiva Modell in Vitrozu bauen. Dieses Gewebe Modell pflegt Co drei Arten von menschlichen Zellen, HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und THP-1 Makrophagen, dreidimensionalen Bedingungen. Dieses Modell kann angewendet werden, für die Untersuchung von parodontaler Erkrankungen wie Gingivitis und Parodontitis.
Abstract
Parodontale Erkrankungen (z.B. Gingivitis, Parodontitis) sind die führenden Ursachen für Zahnverlust bei Erwachsenen. Entzündung im Zahnfleisch ist die grundlegende physiopathologie der Parodontalerkrankungen. Aktuelle experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen entstanden in verschiedenen Arten von Tieren. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente für parodontale Erkrankungen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Rekonstruktion von entzündlichen Gewebe Entsprechungen des Zahnfleisches (iGTE) in Vitro. Wir erstellen zunächst menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (GTE) durch die Verwendung von zwei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich menschliche gingival Fibroblasten (HGF) und menschliche Haut epidermalen Keratinozyten (HaCaT), dreidimensionale Bedingungen. Wir erstellen eine Wunde Modell mithilfe eine Gewebe Puncher, ein Loch in der GTE Punsch. Nächste, menschliche THP-1 Monozyten mit Kollagen Gel gemischt werden in das Loch in der GTE injiziert. Durch Adimistration von 10 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) für 72 h, THP-1-Zellen unterschieden in Makrophagen in Form entzündlicher Herde in GTE (iGTE) (IGTE auch kann sein Stumilated mit 2 µg/mL von Lipopolysacchariden (LPS) für 48 h, Entzündung zu initiieren ). IGTE ist das erste in-vitro- Modell der entzündlichen Gingiva mit menschlichen Zellen mit einer dreidimensionalen Architektur. IGTE spiegelt die wichtigsten pathologische Veränderungen (Immunzellen Activition, intrazellulären Interaktionen zwischen Fibryoblasts, Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen) in parodontale Erkrankungen. GTE, Verwundeten GTE und iGTE dient als vielseitige Werkzeuge, um die Wundheilung zu studieren, Geweberegeneration, Entzündungen, Zell-Zell-Interaktion und Bildschirm mögliche Medikamente für parodontale Erkrankungen.
Introduction
Parodontale Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Zahnverlust bei Erwachsenen. Gingivitis und Parodontitis sind die häufigsten parodontalen Erkrankungen. Die beiden präsentieren Biofilm-vermittelten akute oder chronische entzündliche Veränderungen im Zahnfleisch. Gingivitis ist geprägt von akuten Entzündungen, während Parodontitis in der Regel als chronische Entzündung präsentiert. Bei der histologischen Ebene ausgelöst bakterielle Komponenten die Aktivierung von Immunzellen, wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen1,2. Diese Immunzellen, vor allem Makrophagen, interagieren mit lokalen Zellen (einschließlich Zahnfleisch Epithelzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Osteoblasten) wodurch entzündliche Läsionen im parodontalen Gewebe3,4. Experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen wurden in verschiedene Arten von Tieren, wie Ratten, Hamster, Kaninchen, Frettchen, Eckzähne und Primaten. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente von Parodontalerkrankungen5. Co-Kultur von parodontale Bakterien und menschlichen mündliche Epithelzellen Monolage wurde verwendet, zu untersuchen, den Mechanismus der parodontalen Infektionen6. Dennoch fehlt Monolayer-Kulturen der mündlichen Zellen die dreidimensionale (3D) zelluläre Architektur von intaktem Gewebe; Daher können nicht sie die in-vitro- Situation imitieren.
Hier sind 3D entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (iGTE) gegründet, um parodontale Erkrankungen in Vitrodarstellen. Das 3D-Modell der Parodontalerkrankungen nimmt eine Zwischenstellung zwischen Monolage Zellkulturen und Tiermodellen. Drei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und Makrophagen THP-1, sind Co auf Kollagen Gel angebaut und durch entzündliche Initiatoren iGTE bauen stimuliert. IGTE simuliert eng die in-Vivo -Bedingungen der Zelldifferenzierung, Zell-Zell-Interaktion und Makrophagen Aktivierung im Zahnfleisch. Dieses Modell hat viele Einsatzmöglichkeiten für Drug screening und testen neue pharmakologische Ansätze bei parodontalen Erkrankungen sowie zur Analyse von zellulärer und molekularer Mechanismen in der Wundheilung, Entzündung und Regeneration des Gewebes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll basiert auf Methoden der Schaffung von Gingiva-äquivalente und Subkutane Fettgewebe Äquivalente von vorherigen Berichte8,21,22beschrieben. Obwohl dies eine einfache und einfache Methode, erfordern einige Schritte besondere Aufmerksamkeit. Beispielsweise sollte die Kollagen-Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung, Gelbildung in der Lösung zu vermeiden gehalten werden. Wenn die Kollagen-Mischung in das Kultur e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil von der Japan Society für die Promotion of Science (JSPS) Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (26861689 und 17 K 11813) unterstützt. Die Autoren möchte Herr Nathaniel Green für das Korrekturlesen zu danken.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
References
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
